益生菌在嬰幼兒配方奶粉中穩(wěn)定性的研究

劉曉雪，曹美麗，王雪飛

（黑龍江東方學(xué)院，哈爾濱150086）

0 引言

益生菌是指攝入后通過改善宿主腸道菌群的生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高人和動物健康狀態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。目前應(yīng)用于嬰幼兒奶粉中的益生菌一般為雙歧桿菌和乳桿菌兩種類型[1-4]。國家衛(wèi)生部要求只能添加菌種A、菌種B、菌種C和菌種D、菌種E、菌種F這6種菌種[5-6]。菌種A在食品中穩(wěn)定性良好，能保證產(chǎn)品達(dá)到規(guī)定的活菌數(shù)量。菌種B是目前應(yīng)用最廣泛的益生菌，活菌數(shù)在長時間內(nèi)略有減少，能適應(yīng)胃酸環(huán)境。菌種C和菌種D可以提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)菌群的平衡[7-8]。

本文通過加速實驗，研究添加益生菌的嬰兒配方粉在不同環(huán)境條件下益生菌活菌數(shù)隨時間的變化規(guī)律，以掌握益生菌奶粉的穩(wěn)定趨勢。

1 實驗

1.1 材料

基粉：市售嬰幼兒配方奶粉：一段（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.26%±0.05%）；二段（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.47%±0.05%）；三段（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.49%±0.05%）。

益生菌：菌種A，菌種B，菌種C和菌種D

1.2 儀器與設(shè)備

BT 224 S分析天平；CLIMACELL人工氣候箱；Systec VX高壓滅菌器；Bag Mixer 400均質(zhì)機(jī)；CLASS II A2生物安全柜；HWS-100G恒溫恒濕箱；Transferpette S移液槍；YQX生化培養(yǎng)箱；V20三維V型混料機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 益生菌配方粉的生產(chǎn)工藝

采用干混法向嬰兒配方粉中添加益生菌。

每種菌株以現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)并檢測各個生產(chǎn)階段益生菌的存活數(shù)量，同一批次同一水分活度的基粉每份做三個平行樣。

（1）預(yù)混料。在進(jìn)行預(yù)混料時添加益生菌，預(yù)混料時間為20 min，混料間的溫度為25℃，濕度為50%，采用三維“V”型混料機(jī)。干混后檢測益生菌存活量。

（2）混料。預(yù)混料之后，經(jīng)傳送帶送至混料間混料，混料時間為3 min，混料目的是保證基粉與營養(yǎng)素充分混勻。

（3）包裝?；炝现?，奶粉進(jìn)入包裝車間，奶粉依次經(jīng)過罐裝（罐裝采取鐵罐充氮氣罐裝）、充氮、金屬檢測，產(chǎn)品合格后，取樣進(jìn)行活菌檢測。

（4）貯藏。將合格樣品做穩(wěn)定性試驗，穩(wěn)定性試驗存放條件根據(jù)菌種加速試驗結(jié)果而定，相對濕度不高于70%～85%為準(zhǔn)，定期檢測模擬貨架期下益生菌的存活量[9]。

1.3.2 加速溫度的確定

以菌種A作為預(yù)實驗菌種，將該菌種與配比好的基粉和營養(yǎng)素混料，罐裝，將樣品分別置于60，45，37，25℃等4個不同溫度下進(jìn)行加速試驗，并且定期檢測樣品中益生菌的活菌量。

1.3.3 不同益生菌穩(wěn)定性的確定

以一段、二段、三段奶粉作為基粉，向其中分別加入菌種A，菌種B，菌種C，菌種D，將4種益生菌在37℃存放兩個月，測定其活菌量，評價其加速試驗條件下，儲存時間對益生菌穩(wěn)定性的影響[10-11]。

益生菌活菌量的檢測采用GB 478935-2010中的方法進(jìn)行[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 加速溫度的選擇

溫度是影響益生菌奶粉穩(wěn)定性的重要因素，不管是在生產(chǎn)、運(yùn)輸還是服用時都要注意溫度的控制，溫度過高容易導(dǎo)致益生菌死亡，有研究表明，乳酸菌在37℃生長良好，在80℃高溫條件下5 min其活菌量將減少70%～80%[13-14]。針對溫度對益生菌的影響程艷薇等人曾將嗜酸乳桿菌高溫馴化，馴化后的嗜酸乳桿菌可以在45℃高溫條件下生長[15]。

溫度對益生菌穩(wěn)定性的影響，加速試驗設(shè)計以菌種A作為試驗添加菌種，在加速試驗溫度分別為60，45，37，25℃條件下，以益生菌的活菌量為指標(biāo)進(jìn)行研究并做圖，如圖1～圖4所示。

圖1 60℃加速試驗下的菌種A活菌量

圖2 45℃加速試驗下的菌種A活菌量

益生菌加速試驗是指在保證不改變益生菌產(chǎn)品失效機(jī)理的前提下，通過強(qiáng)化溫度試驗條件，使受試益生菌加速失效，以便在較短時間內(nèi)獲得必要益生菌穩(wěn)定性，來評估益生菌在正常條件下的可靠性或壽命指標(biāo)。

由圖1可以看出，益生菌在60℃時，樣品在第2天檢測菌種A的量就由當(dāng)天的1.40×108g-1下降小于100 g-1，菌種活菌量下降迅速，由于益生菌的活性隨著儲存溫度升高而不斷死亡，使奶粉中中益生菌活力喪失，所以60℃不適合做為加速試驗的加速溫度。

由圖2可以看出，樣品在45℃條件下存放時，菌種A的活菌量下降明顯，樣品在第2天檢測菌種A的含量就由當(dāng)天的1.40×108g-1下降為2.0×107g-1。說明菌株死亡速度較快，因此45℃不利于進(jìn)行菌株間穩(wěn)定性的比較，不宜作為加速實驗的實驗溫度。

圖3 37℃加速實驗下的菌種A活菌量

圖4 25℃加速實驗下的菌種A活菌量

由圖3可以看出，益生菌在37℃貯存期間，菌種A的活菌量含量從當(dāng)天的1.40×108g-1下降到到第35天的4.40×107g-1。在35 d內(nèi)出現(xiàn)活菌量的降低，同時這種降低趨勢明顯，符合加速實驗的要求，利于進(jìn)行后續(xù)的實驗分析。

由圖4可以看出，在25℃儲存條件下，益生菌菌株長時間活菌量沒有明顯的降低，從實驗的初始到第105天活菌量由1.40×108g-1只下降到1.2×108g-1，菌含量變化趨勢并不明顯，不符合加速試驗的目的，在短時間內(nèi)不能很快檢測菌株的穩(wěn)定性。

綜合考慮各種加速試驗的條件，溫度為37℃較為合理，試驗時間不會太長而且還能看到菌株明顯的衰減，可快速判斷不同菌株的穩(wěn)定性。

2.2 益生菌在嬰兒配方粉儲存過程中的穩(wěn)定性變化

2.2.1 菌種A儲存穩(wěn)定性的變化

在37℃加速實驗條件下，菌種A儲存兩個月內(nèi)活菌量的變化如圖5所示。

圖5 37℃儲存條件下菌種A活菌量的變化

圖6 37℃儲存條件下菌種B活菌量的變化

由圖5可以看出，一段、二段和二段奶粉中菌種A在37℃的加速實驗中10 d內(nèi)都出現(xiàn)了活菌量明顯的降低。一段奶粉中菌種A由投料量的3.0×108g-1在10 d內(nèi)降到了2.3×108g-1，隨后活菌量處于緩慢降低的趨勢，總體變化平穩(wěn)，在保存了60 d時活菌量仍高達(dá)1.9×108g-1，表現(xiàn)了比較好的穩(wěn)定性。二段奶粉中菌種A的活菌量10 d內(nèi)由2.2×108g-1降到了2.1×108g-1，在隨后的保存時間里比一段中菌種A的活菌量下降稍快些，但在保存的第60天兩段中活菌量一致，菌種穩(wěn)定性良好。三段奶粉中菌種A的活菌量10 d內(nèi)較一、二段中活菌量下降明顯從3.0×108g-1降到了2.1×108g-1，后期的活菌量也呈現(xiàn)了明顯的下降趨勢，60 d時，活菌量降到了1.6×108g-1，比一、二段奶粉中的活菌量下降明顯，說明奶粉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同對菌種A的存活有影響。從一段到三段水分活度越來越高，水分活度越高越不利于益生菌保持其穩(wěn)定性，水分活度越低益生菌活菌量降低的越慢，有利于保持其穩(wěn)定性[16]。

總體來看菌種A在加速試驗中表現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。

2.2.2 菌種B儲存穩(wěn)定性的變化

在37℃加速實驗條件下，菌種B儲存兩個月內(nèi)活菌量的變化如圖6所示。由圖6可以看出，菌種B在37℃儲存初期活菌量的減少較明顯，儲存10 d之后總菌量緩慢降低，且三個不同水分含量奶粉中菌種B的活菌量變化各不相同，一段乳粉中菌種B的活菌量十天內(nèi)由6.2×108g-1下降到4.6×108g-1，隨后緩慢下降，在第60天時活菌量降到3.5×108g-1，活菌量減少了近1/2。二段乳粉中活菌量10 d內(nèi)由6.2×108g-1下降到4.1×108g-1，較一段下降的明顯，在隨后的加速試驗中活菌量呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢，在第60天降低到3.3×108g-1，總體比一段中的活菌量下降明顯。三段奶粉中活菌量由開始的6.2×108g-1在第十天下降到3.8×108g-1，總體呈現(xiàn)下降趨勢，在第60天降到2.8×108g-1比一、二段奶粉中的活菌量下降的更明顯。三個不同段的奶粉中活菌量的降低具有顯著性（P＜0.05），說明菌種B對水分活度較敏感，總體來說，菌種B的穩(wěn)定性還是比較理想的，可以考慮作為益生菌奶粉的備選菌株，適合在水分活度較低的乳粉中添加。

2.2.3 菌種C儲存穩(wěn)定性的變化

在37℃加速試驗條件下，菌種C儲存兩個月內(nèi)活菌量的變化如圖7所示。

圖7 37℃儲存條件下菌種C活菌量的變化

圖8 37℃儲存條件下菌種D活菌量的變化

由圖7可以看出，菌種C在37℃加速試驗的儲存條件下，衰亡非常迅速，投料的活菌量在4.0×108g-1，但活菌量在30 d內(nèi)呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，當(dāng)儲存至30 d時活菌量下降到1.0×106g-1以下，說明此菌種在嬰兒配方粉中的穩(wěn)定性不佳，不適合添加到乳粉中。

2.2.4 菌種D儲存穩(wěn)定性的變化

在37℃加速試驗條件下，菌種D儲存兩個月內(nèi)活菌量的變化如圖8所示。由圖8可以看出，一、二、三段奶粉中菌種D益生菌在加速實驗的前10 d活菌量下降的非?？?，一、二段奶粉中的活菌量由開始的3.8×108g-1降到1.6×108g-1，三段奶粉中的活菌量由3.8×108g-1降到1.4×108g-1，在隨后的實驗過程中一二段奶粉中的益生菌活菌量下降程度基本相同，在第60天時都降到了1.3×108g-1，但是三段奶粉中活菌量降到了9.2×107g-1，較一二段奶粉中的益生菌衰亡的較快。說明實驗初期菌種D受外界影響比較明顯，菌種失活快，但后期活菌量較穩(wěn)定。因此建議在適當(dāng)加大投料量菌種D還是可以作為備選菌株添加在奶粉中，但是具體生產(chǎn)還要考慮到成本問題。

3 結(jié)論

益生菌作為營養(yǎng)添加劑到嬰幼兒奶粉中，其加速試驗結(jié)果表明最適溫度為37℃，實驗時間不會太長而且還能看到菌株明顯的衰減，可快速判斷不同菌株的穩(wěn)定性。

本研究篩選了4種益生菌添加到嬰兒配方粉中，結(jié)果表明在37℃存放兩個月，菌種A穩(wěn)定性最好，除加速試驗外，在常溫存放了5個月奶粉中活菌量由投料量的3.0×108g-1衰減到2.7×108g-1，活菌量幾乎沒有衰減，在加速實驗5個月后，活菌量只降到添加時活菌量的1/2；其次比較穩(wěn)定的是菌種B和菌種D，這兩種菌株在加速試驗兩個月后活菌量衰減到添加時的1/2；而相比較菌種C較差。因此，菌種A具有較好的穩(wěn)定性，更適宜于作為益生菌添加到嬰幼兒乳粉中。

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