高效液相色譜法檢測(cè)飼料中三唑類殺菌劑殘留

趙春娟 ， 高文惠 *

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊，050018）

三唑殺菌劑是一種殺真菌劑，是指含有1，2，4-三唑環(huán)的化合物，因具有抗菌作用及調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)作用，被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、谷糧等病蟲害的防治。隨著三唑類農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，其在食品、飼料和環(huán)境中的殘留問題也逐漸引起人們的重視。目前，三唑類殺菌劑殘留的檢測(cè)一般采用色譜法，如液相色譜法（張敏等，2012）、液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)（Li等，2012）、氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)（Silva等，2013），但同時(shí)檢測(cè)飼料中4種或4種以上三唑類殺菌劑殘留的研究還鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)分離檢測(cè)飼料樣品中腈菌唑、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇、烯唑醇4種三唑類殺菌劑殘留，以期實(shí)現(xiàn)快速、高效的分離分析效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 LC-20A高效液相色譜儀 （日本島津公司）、KH5200型超聲波清洗器 （昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、LD5-2A低速離心機(jī) （北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）、FA2204分析天平（上海菁海儀器有限公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），聯(lián)苯三唑醇（純度為99%，上海酶聯(lián)生物科技有限公司），腈菌唑（純度為97%，鄭州綠康化工有限公司），烯唑醇、戊唑醇 （純度均為98%，北京金寶在線科技有限公司）。

三唑類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取腈菌唑、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇、烯唑醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，各用乙腈溶解并分別定容至50 mL，使用時(shí)再根據(jù)需要用乙腈稀釋至相應(yīng)濃度。

1.2 色譜條件 色譜柱：Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm， 流動(dòng)相為甲醇-水（85∶15，V/V），流速 1 mL/min，柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

1.3 樣品前處理 稱取2.5 g樣品，用20 mL乙腈提?。ㄌ崛纱危看?10 mL），超聲 15 min，于4000 r/min離心10 min，合并2次上清液，濃縮，定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，待上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)腈菌唑、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇分別進(jìn)行紫外光譜掃描，以確定液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。由圖1可知，腈菌唑、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的最大吸收波長(zhǎng)分別為196、199、214 nm 和 194 nm， 但 甲醇 在 190 ～208 nm有吸收。綜合考慮以上情況，本實(shí)驗(yàn)選擇210 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 腈菌唑、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的紫外光譜圖

2.2 流動(dòng)相和流速的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇、乙腈、甲醇-水作為流動(dòng)相，考察洗脫能力。甲醇和乙腈的洗脫能力均很強(qiáng)，4種三唑類殺菌劑不能實(shí)現(xiàn)分離，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，向甲醇中加入水，采用甲醇-水混合溶劑作為流動(dòng)相，分別考察了甲醇-水體積比為 95∶5、90∶10 和 85∶15， 流速分別為0.5、0.8、1 mL/min時(shí)各三唑類殺菌劑的分離情況。當(dāng)甲醇-水體積比為95∶5和90∶10時(shí)，戊唑醇和聯(lián)苯三唑醇不能實(shí)現(xiàn)完全分離，后將甲醇-水體積比降到85∶15（V/V）時(shí)，戊唑醇和聯(lián)苯三唑醇可實(shí)現(xiàn)基線分離。然后考察了流速對(duì)被測(cè)物保留行為的影響，當(dāng)流速為0.5 mL/min和0.8 mL/min時(shí)，被測(cè)物出峰時(shí)間較長(zhǎng)，且峰形較寬；當(dāng)流速為1 mL/min時(shí)，出峰時(shí)間明顯縮短，峰形好。故本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相比例為 85∶15（V/V），流速為 1 mL/min。此條件下4種三唑類殺菌劑的色譜分離情況如圖2所示，9 min內(nèi)4種殺菌劑實(shí)現(xiàn)了基線分離。

圖2 4種三唑類殺菌劑的分離色譜圖

2.3 線性關(guān)系和檢測(cè)限 移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成濃度為0.05～200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4種三唑類殺菌劑的線性關(guān)系和檢測(cè)限見表1。

表1 4種三唑類殺菌劑的線性關(guān)系及檢測(cè)限

由表1可知，腈菌唑的線性范圍為0.15～200 μg/mL，檢測(cè)限為 0.05 μg/mL；戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的線性范圍為0.3～200 μg/mL，檢測(cè)限為0.1 μg/mL；4種目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)≥0.9938。

2.4 樣品測(cè)定 將雞飼料和豬飼料樣品按照1.3中方法處理，在確定的最佳色譜條件下進(jìn)行樣品測(cè)定。結(jié)果顯示，在雞飼料和豬飼料中均未檢出4種三唑類殺菌劑。圖3為典型樣品雞飼料的色譜分離圖。

圖3 雞飼料的色譜分離圖

2.5 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)雞飼料和豬飼料進(jìn)行低水平和高水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，樣品加標(biāo)平均回收率（AR）為83.4%～101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜3.00%。 表明該法回收率和精密度較高，分析方法可行。

表2 飼料樣品中4種殺菌劑回收率和精密度（n=5） %

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)分離檢測(cè)飼料中4種三唑類農(nóng)藥殘留的高效液相色譜法。腈菌唑、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇、烯唑醇在9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離，4種殺菌劑的線性相關(guān)系數(shù)≥0.9938，腈菌唑的檢測(cè)限為0.05 μg/mL，戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的檢測(cè)限為0.1 μg/mL，樣品加標(biāo)平均回收率為83.4%～101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜3.00%。該方法可用于飼料樣品中三唑類殺菌劑殘留的檢測(cè)。

[1]張敏，黃其亮，殷帥，等.基于離子液體的分散液相微萃取-高效液相色譜法測(cè)定水中三唑類農(nóng)藥[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31（3）：341～345.

[2]Li Y B，Dong F S，Liu，et al.Simultaneous enantioselective determination of triazole fungicides in soil and water by chiral liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2012，1224：51～60.

[3]Silva E A S，Lopez-Avila V，Pawliszyn J.Fast and robust direct immersion solid phase microextraction coupled with gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method employing a matrix compatible fiber for determination of triazole fungicides in fruits[J].Journal of Chromatography A，2013，1313（25）：139～146.