酶菌聯(lián)合降解羽毛的研究

楊 婷， 廖美德， 劉偲嘉， 賀玉廣， 林志峰

（華南農業(yè)大學天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣東廣州510642）

羽毛角蛋白粗蛋白質含量約在80%以上，氨基酸含量在70%以上（傅紅梅，1997），并且含有礦物質元素、維生素以及一些未知的生長因子，是良好的飼料用蛋白資源（張啟等，2007）。但由于其結構中含有大量二硫鍵，一般方法很難將其降解，因此利用率較低。本實驗室初步篩選得到兩株可降解羽毛的真菌，分別為米曲霉和淡紫擬青霉。本試驗對兩種菌種降解羽毛能力進行初步對比，篩選出較適合生產需要的菌種，并添加枯草芽孢桿菌酶液，對酶菌聯(lián)合降解羽毛的能力進行研究，為工業(yè)化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 米曲霉菌 （Aspergillus oryzae）、淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由華南農業(yè)大學實驗室保存；羽毛粉由廣州康順飼料公司提供。

1.2 含羽毛的察氏培養(yǎng)基制作 以察氏培養(yǎng)基為出發(fā)培養(yǎng)基，以羽毛替代其原有氮源，制作改良察氏培養(yǎng)基，在1000 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶中均裝入200 mL液態(tài)培養(yǎng)基，滅菌后備用。

1.3 孢子懸液的制備 將米曲霉 （或淡紫擬青霉）接種到固體PDA中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)，待培養(yǎng)基表面大量形成孢子時，向培養(yǎng)皿中加入無菌水，洗滌米曲霉孢子，合并洗滌孢子懸液后備用。

1.4 羽毛降解試驗 在制備好的羽毛培養(yǎng)基中，分別按2%的接種量接種米曲霉或淡紫擬青霉的孢子懸液，置于30℃、180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，每24 h取樣，抽濾，測定濾液中氨基酸的含量。

1.5 氨基酸含量測定 甲醛滴定法：將濾液置于適當大小的燒杯中，加入20 mL蒸餾水混勻。開動磁力攪拌器，用0.01 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH為8.20，然后快速加入5.0 mL的甲醛溶液（38%）混勻，接著加入NaOH標準溶液繼續(xù)滴定至pH為9.20，記錄加入甲醛后消耗NaOH溶液的量V1。以20 mL的蒸餾水作空白對照，重復上述操作，記錄加入甲醛后的NaOH的消耗量V0（pH=9.20）。

式中：X為樣品中氨基酸的含量，mg/mL；V1為測定用試液加入甲醛后滴定至pH=9.20時NaOH消耗量，mL；V0為空白對照加入甲醛后滴定至 pH=9.20時 NaOH消耗量，mL；C為 NaOH標準溶液的濃度，mol/L；m為樣品體積，mL。

1.6 枯草芽孢桿菌蛋白酶液的制備 取出實驗室內保存的枯草芽孢桿菌，接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h致成熟。然后取出培養(yǎng)液，于3000 r/min離心30 min，上清液為活性蛋白酶液。取活性酶液100 mL于燒杯中，放于100℃水浴鍋水浴加熱1 h，得到失活蛋白酶液。

1.7 酶菌聯(lián)合降解羽毛試驗 設置4個試驗組，A組：200mL粗羽毛察氏培養(yǎng)基+4 mL的淡紫擬青霉孢子水+5 mL活蛋白酶液；B：200 mL粗羽毛察氏培養(yǎng)基+4 mL的淡紫擬青霉孢子水+5 mL失活蛋白酶液；C：200 mL絨羽毛察氏培養(yǎng)基+4 mL的淡紫擬青霉孢子水+5 mL活蛋白酶液；D：200 mL絨羽毛察氏培養(yǎng)基+4 mL的淡紫擬青霉孢子水+5 mL失活蛋白酶液。置于30℃、180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，每24 h取樣，抽濾，測定濾液中氨基酸的含量。并且觀察其結成胨狀的時間以及解除胨狀的時間。

2 結果

2.1 淡紫擬青霉與米曲霉降解羽毛能力對比 由圖1可見，淡紫擬青霉在第4天氨基酸的含量出現(xiàn)高峰期，隨后氨基酸含量回落，可能是淡紫擬青霉需要繼續(xù)生長發(fā)育，利用培養(yǎng)液中的氨基酸合成自身的生長物質，導致測出的氨基酸含量下降。米曲霉培養(yǎng)液中的氨基酸含量變化不算太大，基本上維持在0.025左右?？赡苁敲浊挂贿吔到庥鹈?，一邊利用所得的氨基酸充當氮源，供自身生長。

圖1 淡紫擬青霉和米曲酶降解羽毛能力對比

2.2 酶菌聯(lián)合降解羽毛角蛋白試驗結果 試驗過程中發(fā)現(xiàn)使用粗毛作氮源的A、B組的初始pH從第2天開始便一直呈弱堿性，前3 d的培養(yǎng)基中液體較為清，為水狀；第4天開始變黏稠，第6天開始有結胨現(xiàn)象出現(xiàn)，到第14天，培養(yǎng)液的胨狀解除，再變?yōu)樗疇钆囵B(yǎng)基。整個過程沒有明顯的刺激性氣味，解胨后培養(yǎng)液比絨毛培養(yǎng)基的清稀。

使用絨毛作為氮源的C、D組從接種后的第2天起就有強烈的腐酸氣味，所測初始pH為5，之后幾天所測初始pH均在4～5，第3天C、D組開始較為黏稠，第4天C、D組的酸味減輕，第5天C、D組的酸味再次變重了一點，第7天開始結胨，到第14天培養(yǎng)液的胨狀解除，但是培養(yǎng)液還是比較黏稠。整個培養(yǎng)過程一直有腐酸的氣味，一直到第25天清洗培養(yǎng)基氣味還存在，而且培養(yǎng)基仍然比較黏稠。

由于NaOH的消耗量與溶液中的氨基酸含量成正比，從圖2和圖3可知，加入蛋白酶液后，有利于淡紫擬青霉降解羽毛獲得氨基酸。而且淡紫擬青霉開始結胨時間為第6天，解除胨狀的時間為第14天，比單獨使用淡紫擬青霉降解羽毛提早6 d解胨。加入失活蛋白酶組的氨基酸含量比加入活蛋白酶組的低，但比單獨使用淡紫擬青霉降解羽毛的要高，可能是失活酶液并非完全失活，或者是還有殘留的枯草芽孢桿菌所致。試驗證明了枯草芽孢桿菌產生的酶液對于淡紫擬青霉降解羽毛有較為明顯的促進作用。

圖2 粗毛培養(yǎng)基NaOH消耗量對比

圖3 絨毛培養(yǎng)基NaOH消耗量對比

3 討論

羽毛角蛋白的主要結構中存在大量的二硫鍵，交聯(lián)成為復雜的三維網狀結構，具有良好的穩(wěn)定性和難溶性，一般方法很難將其水解（Wang等，2008）。因此，這些羽毛廢棄物大多未被充分利用，有的甚至污染環(huán)境，造成公害，同時也存在蛋白質資源浪費等問題（Gousterova等，2005）。利用角蛋白酶降解羽毛角蛋白，可將羽毛等廢棄角蛋白直接轉變成蛋白質或復合氨基酸，變廢為寶，既保護環(huán)境又可以實現(xiàn)資源再利用（張啟等，2008）。角蛋白的降解是一個非常復雜的過程，目前普遍認為，微生物降解角蛋白的過程可分為變性作用、水解作用和轉氨基作用三個步驟。王秋影等（2012）研究表明，淡紫擬青霉降解羽毛會出現(xiàn)特有的胨化現(xiàn)象，推測淡紫擬青霉角蛋白酶是很好的復合酶，具有很好的角蛋白二硫鍵水解能力，但將單鏈蛋白水解為氨基酸能力較弱。本研究中加入蛋白酶液的處理組比沒有加蛋白酶液的處理組氨基酸含量高出很多，證明蛋白酶液可促進淡紫擬青霉將單鏈蛋白水解成氨基酸，提高了角蛋白酶活力。

本試驗中還發(fā)現(xiàn)，絨毛培養(yǎng)時培養(yǎng)基呈酸性，粗毛培養(yǎng)時培養(yǎng)基呈弱堿性，猜測是培養(yǎng)基本身氮源組成成分不同所導致的，在絨毛培養(yǎng)的條件下，由于絨毛降解之后可能會產生一些酸性物質，所以會呈現(xiàn)出培養(yǎng)液總體呈酸性的狀態(tài)；而在粗毛培養(yǎng)的條件下，粗毛降解產生一些中性至弱堿性的物質，所以會呈現(xiàn)出弱堿性的狀態(tài)。而且，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)在使用絨毛作為培養(yǎng)基時，氨基酸含量較使用粗毛作培養(yǎng)基時高出近一半的數量。推測原因為由于絨毛中的羽毛較細較軟，羽毛梗相對于粗毛的更少，因此作為培養(yǎng)氮源，與培養(yǎng)液中的菌與酶的接觸面積比粗毛的要大，更容易使其充分反應；雖然絨毛與粗毛都屬羽毛，但是成分有所不同，絨毛中的角蛋白二硫鍵可能較少，在相同時間內，酶降解的速率相同，所以絨毛相對降解的較充分。

4 結論

淡紫擬青霉比米曲霉降解羽毛能力更強，并且降解過程中有很好的富集點，更適合在工業(yè)化生產中降解羽毛制備氨基酸；淡紫擬青霉降解羽毛過程中加入枯草芽孢桿菌酶液，能顯著促進羽毛的降解，比單獨使用淡紫擬青霉降解羽毛提前6 d解胨，說明酶菌聯(lián)合降解羽毛角蛋白效果更好。

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