雙合湯對酒精性股骨頭壞死兔微循環(huán)的影響*

劉華，魏愛淳，秦廣珍，陳清清，周永進

（江蘇省海安縣中醫(yī)院骨傷科，江蘇 海安 226600）

·論著·

雙合湯對酒精性股骨頭壞死兔微循環(huán)的影響*

劉華，魏愛淳，秦廣珍，陳清清，周永進

（江蘇省海安縣中醫(yī)院骨傷科，江蘇 海安 226600）

目的觀察雙合湯對酒精性股骨頭壞死（AOFH）兔微循環(huán)的影響。方法將60只中國白兔隨機分成正常組、模型組、美多巴組及雙合湯低、中、高劑量組。除正常組外，各組給予中國白酒（乙醇含量56%）10 ml/（kg·d）灌胃。在造模同時，各給藥組灌胃給藥，正常組、模型組給予生理鹽水。預防性灌胃給藥8周后測定血漿一氧化氮（NO）、內皮素-1（ET-1）、血清超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）水平。采血后處死實驗動物，觀察組織病理學的變化。結果與正常組比較，模型組的NO、SOD水平顯著下降（P＜0.01），ET-1、MDA水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，雙合湯中、高劑量組可顯著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的NO、ET-1、SOD、MDA水平與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組的空骨陷窩率顯著高于正常組（P＜0.01），軟骨下區(qū)血管計數(shù)顯著低于正常組（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的空骨陷窩率明顯低于模型組（P＜0.01），軟骨下區(qū)血管計數(shù)明顯高于模型組（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論雙合湯能有效改善AOFH兔微循環(huán)，從而防治AOFH。

酒精性股骨頭壞死；雙合湯；微循環(huán)；一氧化氮；內皮素-1；自由基

酒精性股骨頭壞死（alcohol-inducedosteonecrosis of the femoral head，AOFH）是導致非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）最為常見的因素之一，是由乙醇攝入過量導致[1]。AOFH的西醫(yī)治療主要以人工全髖關節(jié)置換術為主。由于AOFH患者大部分為青壯年，而人工關節(jié)的使用壽命有限[2]，患者日后面臨多次翻修術的可能。雖然ONFH確切的發(fā)病機制尚未完全闡明，但普遍認為其病理基礎為骨內微循環(huán)障礙。祖國醫(yī)學以痰瘀同治為非創(chuàng)傷性ONFH的基本治則，在緩解疼痛和改善功能方面，取得較為滿意的療效[3]。雙合湯出自清代名醫(yī)沈金鰲所著《雜病源流犀濁》，筆者將其應用于AOFH的臨床治療多年，收益患者較多。本實驗通過觀察雙合湯對AOFH兔微循環(huán)的影響，探討雙合湯對AOFH的治療作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

健康成年中國白兔60只，平均體重（2.5±0.3）kg，雌雄各半，由南通大學實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK（蘇）2012-0031。美多巴（0.25g/片）由上海羅氏制藥有限公司提供，中國白酒（乙醇含量56%）由北京紅星股份有限公司提供。

雙合湯由本院中藥房提供，其處方為：桃仁6 g、當歸9 g、白芍9 g、川穹9 g、紅花6 g、陳皮9 g、半夏9 g、茯苓9 g、白芥子9 g、生地黃9 g、生姜6 g、甘草6 g及竹瀝30 g，將藥物加水浸沒180 min后煎煮2次，第1次加8倍的水煎煮90 min，濾取煎液，藥渣加6倍量的水煎煮60 min，2次煎液合并，減壓濃縮至每毫升藥液相當于1～2 g生藥，備用。一氧化氮（nitric oxide，NO）、內皮素-1（endothelin-1，ET-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購自上海奧斯生物試劑公司，TDL80-2B臺式離心機購自上海安亭科學儀器有限公司，分光光度計購自上海強申生化儀器廠，γ放射免疫計數(shù)器購自科大創(chuàng)新股份有限公司，光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 動物分組

按隨機數(shù)字表法，將中國白兔分成6組，即正常組、模型組、美多巴組、雙合湯低劑量組、雙合湯中劑量組及雙合湯高劑量組，每組10只。

1.3 AOFH動物造模及給藥

參照劉忠堂等[4]方法進行造模，所有動物飼養(yǎng)于南通大學實驗動物中心，每組兔在同樣條件下單獨分籠飼養(yǎng)，自由飲食，溫度、換氣、照明等飼養(yǎng)環(huán)境控制在規(guī)定范圍內，飼養(yǎng)1周適應環(huán)境后開始實驗，采用灌胃法，除正常組外其余各組給予同種中國白酒10 ml/（kg·d）灌胃。采用白酒灌胃同時，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予50、100和50 ml雙合湯灌胃，每日早晚各1次；美多巴組給予0.125 g美多巴灌胃，每日早晚各1次；正常組、模型組以100 ml生理鹽水灌胃，每日早晚各1次。

1.4 微循環(huán)指標的測定

兔給藥8周后，禁食12 h，在兔耳中心靜脈取血10 ml，以3 500 r/min離心20 min，分離出血漿、血清。然后采用硝酸還原酶法測定血漿NO水平；采用放射免疫法測定血漿ET-1水平；采用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD水平；采用硫代巴比妥酸比色法測定過氧化脂質（lipid peroxides，LPO）代謝物，即血清MDA水平代表LPO的水平。以上操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 組織形態(tài)學觀察

采血后，以空氣栓塞法處死實驗動物，取雙側股骨頭沿冠狀面切開，10%福爾馬林溶液固定，5%稀硝酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，顯微鏡下觀察骨細胞、骨髓脂肪細胞及骨小梁結構。骨細胞壞死病理變化以空骨陷窩率表示，即在高倍鏡下，隨機選10個視野，在每個視野中記數(shù)50個骨陷窩，數(shù)出其中的空骨陷窩數(shù)，然后計算空骨陷窩占50個骨陷窩數(shù)的百分比。在中倍鏡下，任選10個視野，通過墨染程度，進行軟骨下區(qū)血管計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組NO、ET-1、SOD、MDA水平比較

模型組的NO、SOD顯著低于正常組（P＜0.01）；模型組的ET-1、MDA顯著高于正常組（P＜0.01）。與模型組比較，雙合湯低劑量組和美多巴組可降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.05）。與模型組比較，雙合湯中、高劑量組可顯著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的NO、ET-1、SOD、MDA與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組NO、ET-1、SOD、MDA水平比較（±s）

表1 各組NO、ET-1、SOD、MDA水平比較（±s）

注：1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01

組別NO/（μmol/L）ET-1/（pg/ml）SOD/（u/ml）MDA/（nmol/L）正常組24.49±5.8713.32±3.95243.5±29.922.73±0.43模型組13.14±4.061）25.68±5.981）139.4±21.571）4.96±0.711）美多巴組20.53±4.952）19.39±4.822）203.7±24.632）3.78±0.592）低劑量組19.98±4.892）20.13±4.872）201.8±24.282）3.81±0.612）中劑量組23.68±5.693）14.01±3.983）240.9±29.693）2.86±0.473）高劑量組23.84±5.773）13.64±4.033）241.3±29.743）2.81±0.453）

2.2 組織形態(tài)學觀察

2.2.1 模型組骨小梁內殘留少數(shù)正常骨細胞，骨細胞空骨陷窩多見；軟骨下骨髓區(qū)見大片骨髓組織明顯脂肪變性、壞死，髓內血管的管腔變狹窄，其內見較多血栓與脂肪栓子。見圖1。

圖1 模型組（HE×100）

2.2.2 美多巴組骨小梁內殘留的正常骨細胞占一半，可見骨細胞空骨陷窩；軟骨下骨髓區(qū)見部分骨髓組織脂肪變性、壞死，部分髓內血管的管腔變狹窄，其血栓與脂肪栓子比模型組減少。低劑量組與美多巴組類似。見圖2。

圖2 低劑量組（HE×100）

2.2.3 中劑量組骨小梁內殘留的正常骨細胞占大部分，可見少許骨細胞空骨陷窩；軟骨下骨髓區(qū)見少許骨髓組織脂肪變性、壞死，少許髓內血管的管腔變狹窄，少許血栓與脂肪栓子形成。見圖3。

圖3 中劑量組（HE×100）

2.2.4 高劑量組骨小梁內的正常骨細胞占絕大部分，可見少許骨細胞空骨陷窩；軟骨下骨髓區(qū)見少許骨髓組織脂肪變性、壞死，少許髓內血管的管腔變狹窄，但未見明顯血栓與脂肪栓子形成。見圖4。

2.2.5 正常組表現(xiàn)為完整結構的正常股骨頭組織。見圖5。

2.3 各組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)比較

模型組空骨陷窩率顯著高于正常組（P＜0.01）；模型組軟骨下區(qū)血管計數(shù)顯著低于正常組（P＜0.01）。雙合湯低劑量組與美多巴組空骨陷窩率低于模型組（P＜0.05）；雙合湯低劑量組與美多巴組軟骨下區(qū)血管計數(shù)高于模型組（P＜0.05）。雙合湯中、高劑量組空骨陷窩率明顯低于模型組（P＜0.01）；雙合湯中、高劑量組軟骨下區(qū)血管計數(shù)明顯高于模型組（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖4 高劑量組（HE×100）

圖5 正常組（HE×100）

表2 各組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)比較（±s）

表2 各組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)比較（±s）

注：1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01

組別空骨陷窩率/%軟骨下區(qū)血管計數(shù)/例正常組10.63±3.259.00±2.45模型組23.94±6.311）5.50±1.861）美多巴組16.86±4.832）7.20±2.1 72）低劑量組17.04±4.912）7.15±2.1 22）中劑量組11.1 9±3.483）8.79±2.383）高劑量組11.01±3.373）8.86±2.413）

3 討論

長期酗酒成為ONFH最為常見的因素之一，酒精中毒是AOFH一個確定的病因[5]，但AOFH確切的發(fā)病機理尚未完全闡明。近年來提出多種學說，如脂質代謝紊亂與酒精的細胞毒作用學說、脂肪栓塞與局部血管內凝血學說、骨髓基質細胞成脂分化學說、骨細胞脂肪變性等。但學者普遍認為骨內微循環(huán)障礙為ONFH的病理基礎，而微血管損傷則是導致骨內微循環(huán)障礙的最重要因素[6]。在本實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)模型組中股骨頭出現(xiàn)片狀墨汁缺乏現(xiàn)象，提示在AOFH過程中，血管損傷是一個極為重要的環(huán)節(jié)。

NO為血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）釋放最為重要的血管舒張因子，其減少是血管內皮功能失調的主要表現(xiàn)，ET-1是與NO生理作用相拮抗的生物活性物質。在VEC中，NO由NO合成酶催化L-精氨酸生成，NO是細胞間信息傳遞的主要調節(jié)因子，NO可使血管平滑肌內的鳥苷酸環(huán)化酶激活，環(huán)磷酸鳥苷濃度升高，游離Ca2+濃度降低，使血管平滑肌松弛，血管舒張。ET-1是ET家族3種異構體之一，分布在VEC中的ET-1是ET家族中發(fā)揮生物學效應最主要的形式。ET-1與血管平滑肌細胞表達的內皮素A型受體結合可收縮血管，ET-1是至今為止最強烈的血管收縮肽，其收縮血管效應最持久。正常生理條件下，ET-1與NO保持相對動態(tài)平衡，共同維持血管的正常壓力與血液的良好流動狀態(tài)。但在病理條件下，VEC功能受損時，NO釋放減少、ET-1釋放增多，兩者原有的動態(tài)平衡失調，導致血管內皮損傷[7]，這些改變發(fā)生于股骨頭及其滋養(yǎng)血管，導致股骨頭內微循環(huán)障礙，發(fā)生ONFH[8]。本研究結果顯示，模型組的NO水平顯著低于正常組，而ET-1水平顯著高于正常組，這與齊振熙等[8]的研究結果一致。另外，模型組中可見髓內血管的管腔變狹窄，其內有較多血栓與脂肪栓子，說明AOFH中存在微循環(huán)障礙。齊振熙等[8]認為長期酗酒可引起血液中ET-1水平升高，使血管強烈收縮，但靜脈的收縮作用明顯強于動脈，致使股骨頭內形成高灌低排的狀態(tài)，髓內血液淤積，微血管內栓塞較易形成。此外，ET-1還可引起血管平滑肌收縮，導致血管腔變狹窄，血栓更易形成；血液中NO水平的減少使血管舒張功能下降，致使股骨頭內微血管灌注不足，最終引起股骨頭內供血不足。

本研究結果還顯示，模型組的SOD水平顯著低于正常組，而MDA水平顯著高于正常組，這與MEYE等[9]研究的結果相似，說明AOFH中存在氧自由基代謝異常。SOD為機體防御內、外環(huán)境中超氧離子損傷的主要酶，能清除機體內氧自由基，具有保護生物膜與血紅蛋白免受損傷的作用。LPO為氧自由基與細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧反應的產物，重要損傷部位是亞細胞器與細胞膜，能破壞生物膜，增加血小板的聚集性。LPO是反應自由基對機體損傷的指標。MDA是LPO的最終產物，其在組織中的水平可直接反應機體脂質過氧反應程度。正常生理條件下，自由基的產生與清除保持平衡，長期酗酒可引起氧自由基代謝異常，股骨頭局部SOD活性降低，LPO水平增加，過多的自由基損傷毛細血管壁，不僅可引起血管內凝血、血栓形成，導致骨內微循環(huán)障礙，還可增加骨髓內水腫，導致缺血程度加重。同時，血小板與白細胞積聚并產生自由基，可誘發(fā)組織釋放組織胺，組織胺作用于微血管上皮細胞，增強毛細血管的通透性，使骨內微循環(huán)障礙，導致股骨頭缺血性壞死[8]。MEYE等[9]認為酒精毒性作用使自由基生成增多，導致自由基的主要清除劑——SOD活性降低，LPO反應增強，通過影響細胞膜的通透性引起VEC損傷，小動脈發(fā)生纖維變性與粥樣硬化，血供不足，最終導致股骨頭血運障礙而發(fā)生壞死。

黃立新等[10]應用美多巴治療早期AOFH，隨訪27.8個月，患者臨床癥狀、X線與MRI表現(xiàn)有明顯改善。呂智等[11]的動物實驗研究顯示，美多巴能使血漿內生長激素明顯升高，促進壞死股骨頭內的新骨形成，從而增強壞死股骨頭的力學性能。本實驗亦選用美多巴作為對照藥物。在臨床中，筆者將ONFH辨證分型為氣滯血瘀型、痰瘀痹阻型及肝腎虧虛型，AOFH歸屬于痰瘀痹阻型，嗜酒無度損傷脾胃，導致脾失健運，肝失疏泄，濕熱內蘊，痰濁郁結，瘀血阻滯。劉道兵等[3]經過多年的研究提出脾虛生痰，由痰致瘀，因瘀致痹的非創(chuàng)傷性ONFH學說，以及健脾化痰與活血通絡的痰瘀同治基本原則。

雙合湯有活血化瘀、祛痰通絡的作用，方中桃仁、紅花、當歸、川穹有活血化瘀、通絡止痛的作用，半夏、茯苓、白芥子、鮮竹瀝、陳皮有祛痰的作用，白芍有酸斂肝陰的作用，生地有黃養(yǎng)肝陰而泄伏熱的作用，生姜汁、甘草有溫中健脾、調和諸藥的作用，筆者根據(jù)酒精導致ONFH的病因特點，認為痰瘀痹阻正是早中期AOFH的發(fā)病機制，故在臨床上，使用雙合湯加減治療塌陷前期AOFH，并獲得較理想療效。

其實雙合湯是以桃紅四物湯與二陳湯合并，并配以白芥子、竹瀝祛痰組成?，F(xiàn)代藥理研究證實，桃紅四物湯具有保護血管內皮細胞與改善血管內皮細胞的分泌功能，通過改善血液流變學而降低血脂[12]；徐世紅等[13]的研究表明，桃紅四物湯具有促進骨髓間充質干細胞增殖和成骨性分化活性的作用；二陳湯能有效調節(jié)脂質代謝紊亂[14]。

本研究結果顯示，與模型組比較，雙合湯中、高劑量組可顯著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平；中劑量組中見少許髓內血管管腔變狹窄，其內少許血栓與脂肪栓子形成，而高劑量組中未見髓內血管內明顯血栓與脂肪栓子形成；雙合湯中、高劑量組空骨陷窩率明顯低于模型組，軟骨下區(qū)血管計數(shù)明顯高于模型組，提示雙合湯能緩解酒精引起的VEC損害，恢復NO與ET-1、氧自由基代謝平衡，改善股骨頭局部的微循環(huán)，從而起防治AOFH的作用。

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（申海菊 編輯）

Effect of Shuanghe Decoction on microcirculation of rabbits with alcohol-induced osteonecrosis of femoral head*

Hua LIU,Ai-chun WEI,Guang-zhen QIN,Qing-qing CHEN,Yong-jin ZHOU
(Department of Orthopedics,Chinese Medicine Hospital of Haian,Haian, Jiangsu 226600,P.R.China)

【Objective】To observe the effect of Shuanghe Decoction on microcirculation of Chinese white rabbits with alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head(AOFH).【Methods】In this study 60 Chinese white rabbits were randomly divided into normal group,model group,Madopar group,and low-,medium-and high-dose Shuanghe Decoction groups.Except the normal group,each group was lavaged with Chinese spirit (alcohol content 56%)10 ml/（kg·d）.Meanwhile each dose group was lavaged with the drug.The normal group and the model group were given normal saline.After 8 weeks the rabbits were sacrificed to collect blood for determination of nitric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA).The rabbits were killed after collection of blood,and histopathological changes were detected.【Results】Compared with the normal group,the levels of NO and SOD in the model group were significantly decreased(P＜0.01),and the levels of ET-1 and MDA in the model group were significantly increased(P＜0.01).Compared with the model group,the levels of ET-1 and MDA were significantly decreased in the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups,and the levels of NO and SOD were significantly increased(P＜0.01).Differences in the levels of NO,ET-1,SOD and MDA between the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups and the normal group had no statistical significance(P＞0.05).Compared with the normal group,the empty bone lacuna rate in the model group was significantly increased(P＜0.01), and the blood vessel count in hypotegum of cartilage was significantly decreased(P＜0.01).Compared with the model group,the empty bone lacuna rate was significantly decreased in the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups(P＜0.01),and the blood vessel count in hypotegum of cartilage was significantly increased(P＜0.01).Differences of the empty bone lacuna rate and blood vessel count in hypotegum of cartilage between the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups and the normal group had no statistical significance(P＞0.05).【Conclusion】Shuanghe Decoction can effectively improve the microcirculation of rabbits with AOFH,thus prevent and cure AOFH.

alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head；Shuanghe Decoction；microcirculation；nitric oxide；endothelin-1；free radical

R274.9

A

1005-8982（2015）29-0039-05

2015-01-04

江蘇省南通市市級科技計劃項目（No：HS13933）

魏愛淳，E-mail：jshawac@163.com