實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)克氏原螯蝦體內(nèi)白斑癥病毒（WSSV）的動(dòng)態(tài)變化

張 玲，唐小千，繩秀珍，戰(zhàn)文斌

（中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266003）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)克氏原螯蝦體內(nèi)白斑癥病毒（WSSV）的動(dòng)態(tài)變化

張 玲，唐小千，繩秀珍，戰(zhàn)文斌

（中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266003）

本文建立了白斑癥病毒（WSSV）實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示其線性關(guān)系良好，利用建立的WSSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)感染了WSSV后克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）組織內(nèi)病毒數(shù)量的時(shí)序動(dòng)態(tài)變化。注射WSSV粗提液感染克氏原螯蝦，在感染后0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h分別取螯蝦鰓、血淋巴、心臟、附肢、造血組織和肌肉，提取組織DNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定WSSV濃度，發(fā)現(xiàn)感染后3h在附肢、鰓、血淋巴和造血組織中檢測(cè)到病毒，12h時(shí)在各組織中皆檢測(cè)到病毒，但濃度較低；24～48h內(nèi)WSSV濃度呈指數(shù)增長(zhǎng)，此時(shí)螯蝦出現(xiàn)少量死亡；60～72h內(nèi)WSSV數(shù)量緩慢增長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期，螯蝦累計(jì)死亡率快速升高。不同組織中的WSSV濃度有較大差異，附肢中濃度最高，血淋巴、鰓、心臟和造血組織稍低，肌肉中WSSV濃度最低；附肢中WSSV動(dòng)態(tài)變化代表了WSSV增殖變化規(guī)律，是很好的病毒檢測(cè)與病程進(jìn)展評(píng)估材料。本文結(jié)果可為WSSV的早期診斷提供技術(shù)支持，為闡明WSSV感染增殖規(guī)律提供資料。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）；白斑癥病毒（WSSV）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；病毒增殖

在養(yǎng)殖蝦類的病毒性病原中，白斑癥病毒（WSSV）是給蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)?yè)p失最大的一種病毒[1-2]。自白斑癥病毒病在20世紀(jì)90年代初期首次大規(guī)模暴發(fā)以來(lái)，全世界有超過(guò)30個(gè)國(guó)家的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)受其影響，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。WSSV的宿主范圍非常廣泛，可以感染對(duì)蝦、龍蝦、螯蝦、蟹類、橈足類等40余種甲殼類動(dòng)物和水生浮游動(dòng)物[3-4]，其感染的靶器官主要包括上皮組織、造血組織、結(jié)締組織、鰓、胃、血淋巴、附肢、觸角腺、前后腸上皮、橫紋肌、心臟等部位。目前，WSSV感染和致病機(jī)理尚不明晰，且缺乏有效的治療措施。盡早發(fā)現(xiàn)病毒并采取相應(yīng)措施阻止病毒傳播，綜合調(diào)控以預(yù)防疾病發(fā)生是相對(duì)有效的防病策略是防控該病的有效策略[4]。

有學(xué)者將WSSV在蝦體內(nèi)的感染分為輕、中、重度感染階段，發(fā)現(xiàn)在WSSV輕度感染階段可以通過(guò)調(diào)整飼養(yǎng)和環(huán)境條件使蝦存活下來(lái)，達(dá)到中或重度感染階段后，則可能會(huì)在幾天時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)大量死亡[5]。所以，有效的管理要求我們?cè)赪SSV輕度感染階段向中、重度感染階段過(guò)渡之前檢測(cè)到病毒，從而為養(yǎng)殖企業(yè)提供時(shí)間，改善養(yǎng)殖條件避免疾病暴發(fā)或及時(shí)收獲，以降低經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立靈敏、準(zhǔn)確的WSSV檢測(cè)技術(shù)，分析蝦組織中WSSV的感染增殖動(dòng)態(tài)變化，可以為評(píng)估WSSV感染進(jìn)程，預(yù)防WSSV病的發(fā)生提供資料。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有靈敏性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多種病原的診斷[6-7]。本文選擇WSSV的易感宿主克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）作為模式動(dòng)物，利用建立的WSSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)間點(diǎn)螯蝦組織中的病毒數(shù)量動(dòng)態(tài)變化，以期為WSSV的早期診斷提供技術(shù)支持，為闡明WSSV感染增殖規(guī)律提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和病毒

克氏原螯蝦購(gòu)自山東省某養(yǎng)殖場(chǎng)，利用PCR技術(shù)檢測(cè)蝦鰓確認(rèn)沒(méi)有感染W(wǎng)SSV[8]。將螯蝦暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室，每天換水一次，一周后用于感染實(shí)驗(yàn)。取患白斑病的中國(guó)對(duì)蝦鰓，每1g鰓中加入5mL磷酸緩沖液（PBS），冰浴充分研磨3～5min，將研磨液過(guò)濾到50mL離心管內(nèi)，4℃下經(jīng)3000 r/min離心20min，取上清液作為WSSV粗提液，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定WSSV粗提液病毒濃度并使用PBS將其濃度調(diào)節(jié)為8拷貝/μL用作接種液。

1.2 感染實(shí)驗(yàn)

將健康克氏原螯蝦分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2個(gè)對(duì)照組，每組300只螯蝦，暫養(yǎng)一周后將水溫逐漸升至25℃。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組每只螯蝦肌肉注射約100μL 濃度為8拷貝/μL WSSV接種液[9]，2個(gè)對(duì)照組每只螯蝦肌肉注射100μL PBS溶液。實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組1分別于感染后0、3、6、12、24、36、48、60、72h隨機(jī)取5只活蝦，同時(shí)對(duì)瀕臨死亡或剛剛死亡的螯蝦進(jìn)行取樣，采集鰓、血淋巴、心臟、肌肉、附肢和造血組織，其中血淋巴按1∶1（V/V）加入抗凝劑，立即置-80℃保存。另外，統(tǒng)計(jì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組2螯蝦的累積死亡數(shù)，計(jì)算累計(jì)死亡率。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將WSSV囊膜蛋白VP28編碼DNA使用引物VP28F/VP28R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段進(jìn)行回收純化，然后將目的片段插入pMD19-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α進(jìn)行大量擴(kuò)增，使用PCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性菌落，將陽(yáng)性菌送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將含質(zhì)粒的大腸桿菌菌株DH5α按1μL/mL的比例接種于含抗生素LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以質(zhì)粒小量試劑盒抽提質(zhì)粒，使用儀器NanoDrop8000測(cè)定質(zhì)粒核酸濃度并換算為質(zhì)?？截悢?shù)。將獲得的質(zhì)粒10倍系列梯度稀釋，共8個(gè)梯度，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，繪制WSSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查看擴(kuò)

增曲線和溶解曲線，反應(yīng)體系包括引物QVP28F/ QVP28R（表1）各1μL，蒸餾水5μL，模板3μL，SYBR Green 10μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，51℃退火10s，72℃延伸20s，共45個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析（使用Roche480默認(rèn)程序）：95℃ 5s，65℃ 1min，溫度由65℃上升到97℃，此過(guò)程不斷收集熒光信號(hào)，形成熔解曲線。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.4 螯蝦組織中WSSV數(shù)量檢測(cè)

利用Tiangen海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，提取不同時(shí)間點(diǎn)螯蝦各組織DNA，使用儀器NanoDrop8000測(cè)定提取各組織DNA的核酸濃度，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)鰓、血淋巴、心臟、肌肉、附肢、造血組織中WSSV拷貝數(shù)，反應(yīng)體系包括引物QVP28F/ QVP28R（表1）各1μL，蒸餾水5μL，模板3μL，SYBR Green 10μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，51℃退火10s，72℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析（Roche480默認(rèn)程序）：95℃ 5s，65 ℃ 1min，溫度由65 ℃上升到97 ℃，此過(guò)程不斷收集熒光信號(hào)，形成熔解曲線。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將WSSV囊膜蛋白VP28基因目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小約為627bp左右，與預(yù)期大小一致，濃度較高（圖1A）。通過(guò)鏈接至pMD-19-T載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，PCR陽(yáng)性菌落檢測(cè)電泳，獲得了與目標(biāo)片段大小一致的條帶，濃度較高，表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化入大腸桿菌體內(nèi)，在大腸桿菌體內(nèi)大量復(fù)制。PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落經(jīng)測(cè)序，登陸NCBI，將測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)，吻合率為100%，表明該載體為成功構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；試劑盒提取質(zhì)粒電泳結(jié)果顯示，大小約為3319bp左右，說(shuō)明質(zhì)粒提取完整（圖1B）。不同梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行定量熒光PCR，對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物作熔解曲線，只有一個(gè)特異性吸收峰，沒(méi)有非特異性雜峰，熔解溫度為83℃（圖2），表明使用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性較好。

根據(jù)NanoDrop8000測(cè)定核酸濃度換算所得質(zhì)粒濃度為3.7×109拷貝/μL，10倍系列梯度稀釋，共8個(gè)梯度，分別為3.7×108～3.7×101拷貝/μL，進(jìn)行熒光定量PCR，各梯度的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)典型的“S”型，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線近乎重疊，隨著質(zhì)粒濃度的降低，其對(duì)應(yīng)的Ct值相應(yīng)增加，兩者之間呈現(xiàn)良好的相關(guān)性（圖3a）。計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值的相關(guān)性，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ct = -3.2658x+34.083（x為質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)），相關(guān)系數(shù)R2=0.9967（圖3b），表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，即在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在感染W(wǎng)SSV后24h內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；感染后24～48h內(nèi)，出現(xiàn)少量死亡；在48～72h內(nèi)，出現(xiàn)大量死亡；然后死亡速度下降，96h時(shí)累積死亡率為100%（圖4）。對(duì)照組螯蝦沒(méi)有出現(xiàn)死亡。

圖1 WSSV VP28基因片段的擴(kuò)增及鑒定

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

圖3 WSSV VP28基因熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線（a）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（b）

圖4 感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)間點(diǎn)螯蝦的累計(jì)死亡率曲線

2.3 螯蝦組織中WSSV數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

以感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)間點(diǎn)螯蝦各組織DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖5），注射感染W(wǎng)SSV后3h時(shí)，在螯蝦血淋巴、鰓、附肢和造血組織中檢測(cè)到WSSV；感染后12h時(shí)，在肌肉和心臟組織中檢測(cè)到WSSV。不同組織中的WSSV濃度有較大差異。在感染W(wǎng)SSV后3～12h內(nèi)，血淋巴中的WSSV濃度較低且增長(zhǎng)緩慢；24～48h內(nèi)WSSV濃度呈指數(shù)增加；48～72h內(nèi)WSSV濃度維持在較高水平但增長(zhǎng)速度變慢，且明顯低于瀕臨死亡的螯蝦血淋巴中WSSV數(shù)量（7.94×105拷貝/ngDNA）。鰓組織內(nèi)的WSSV濃度在感染后6h內(nèi)增長(zhǎng)緩慢；12～24h時(shí)WSSV濃度迅速顯著增加；在36～72h時(shí)WSSV濃度增加緩慢，但維持在一個(gè)較高的水平；瀕臨死亡的螯蝦鰓中WSSV濃度為3.95×105拷貝/ngDNA。肌肉在感染后12h時(shí)檢測(cè)到少量WSSV，從24h開(kāi)始至48h內(nèi)WSSV濃度呈指數(shù)增加；48h～72h時(shí)WSSV濃度增加變慢；瀕臨死亡的螯蝦肌肉中WSSV濃度為4.35×103拷貝/ngDNA。附肢中WSSV濃度在感染后12h內(nèi)增長(zhǎng)緩慢，24～48h內(nèi)WSSV濃度呈指數(shù)增長(zhǎng)，然后病毒濃度增長(zhǎng)變慢且維持在一個(gè)較高的水平；瀕

臨死亡螯蝦附肢中WSSV濃度為1.03×106拷貝/ ngDNA。心臟中WSSV濃度在感染后12h內(nèi)增長(zhǎng)緩慢且濃度較低；24～60h時(shí)，WSSV濃度顯著增加；60～72h時(shí)，WSSV濃度增加速度變慢；瀕臨死亡螯蝦心臟組織中WSSV濃度為3.95×105拷貝/ngDNA。造血組織中WSSV濃度在感染后12h內(nèi)較低，增長(zhǎng)速度緩慢，在24～36h時(shí)WSSV濃度顯著增加；48～72h時(shí)，WSSV濃度增長(zhǎng)速度變慢；瀕臨死亡螯蝦造血組織中WSSV濃度為1.19×105拷貝/ngDNA。

圖5 感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)間點(diǎn)取樣組織及瀕臨死亡螯蝦組織中WSSV數(shù)量測(cè)定

3 討論

熒光定量PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)病毒基因組的拷貝數(shù)在一定范圍內(nèi)定量檢測(cè)病毒[10]，已證實(shí)病毒的個(gè)數(shù)與病毒基因組的拷貝數(shù)有非常密切的正相關(guān)關(guān)系[11]。VP28作為WSSV主要的囊膜蛋白，是WSSV主要致病蛋白之一，在囊膜完整的WSSV中含量很高[12]。本文利用WSSV囊膜蛋白VP28基因設(shè)計(jì)特異性引物，成功構(gòu)建其重組質(zhì)粒，建立了WSSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于WSSV定量檢測(cè)。

本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)跟蹤檢測(cè)了WSSV感染后鰲蝦組織中病毒數(shù)量的時(shí)序變化，發(fā)現(xiàn)在從注射感染W(wǎng)SSV到螯蝦出現(xiàn)大量死亡的過(guò)程中，螯蝦各組織中的WSSV濃度大致呈S型增長(zhǎng)，感染后12h內(nèi)在各組織中皆檢測(cè)到病毒，但濃度較低，此時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)死亡；多數(shù)組織中WSSV濃度的指數(shù)增長(zhǎng)發(fā)生在感染后24～48h內(nèi)，此時(shí)螯蝦出現(xiàn)少量死亡；感染后60～72h內(nèi)各組織中WSSV數(shù)量達(dá)到緩慢增長(zhǎng)的平臺(tái)期，此時(shí)WSSV濃度較高，螯蝦累計(jì)死亡率快速增長(zhǎng)，顯示出螯蝦體內(nèi)WSSV濃度與螯蝦死亡率呈密切的正相關(guān)關(guān)系，與Tang等所得的南美白對(duì)蝦體內(nèi)WSSV濃度與蝦患病嚴(yán)重程度呈密切正相關(guān)關(guān)系的結(jié)果一致[13]。本文分析發(fā)現(xiàn)鰲蝦附肢中WSSV動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)代表了多數(shù)樣品組織中的WSSV增殖規(guī)律，感染后各時(shí)間點(diǎn)附肢中WSSV濃度比大部分組織要高，瀕臨死亡鰲蝦附肢中的WSSV濃度也高于其他各組織，與文獻(xiàn)報(bào)道的附肢具有較高的WSSV檢出率相一致[14]，因此，附肢是很好的WSSV檢測(cè)材料，根據(jù)附肢中的WSSV濃度來(lái)判斷感染進(jìn)程具有重要參考價(jià)值，并且切除附肢比切除其他組織例如鰓、肌肉等對(duì)蝦體帶來(lái)的傷害小，目前在實(shí)驗(yàn)室及養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)中常用附肢作為首選的WSSV檢測(cè)材料[15]。Sun等綜合蝦的死亡情況與附肢中WSSV濃度，將中國(guó)對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后的發(fā)展階段劃分為輕、中、重度感染階段[9]，與本文中WSSV感染鰲蝦后病程發(fā)展12h內(nèi)沒(méi)有死亡、24～48h少量死亡及60～72h內(nèi)大量死亡的結(jié)果相一致。另外，血淋巴和鰓中WSSV濃度具有與附肢相似的變化趨勢(shì)，只是病毒濃度稍低，也是較好的WSSV檢測(cè)樣品材料。本文結(jié)果說(shuō)明WSSV感染后48h內(nèi)是病毒增殖的關(guān)鍵期，而病毒增殖達(dá)到平臺(tái)期以后是最有可能發(fā)生規(guī)模性死亡的時(shí)期，因此，檢測(cè)到病毒后，要盡早采取措施干擾病毒復(fù)制或切斷病毒傳播，改善水環(huán)境條件，增強(qiáng)蝦體免疫力，減慢病毒增殖速度，以減少規(guī)模性死亡發(fā)生的可能性。當(dāng)然，在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，WSSV初始感染濃度可能較低，病毒增殖達(dá)到致死濃度所需要的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，可能有更多時(shí)間采取相應(yīng)預(yù)防措施。

在WSSV感染后不同鰲蝦組織中病毒檢出時(shí)間、增殖速度與數(shù)量有較大差異。肌肉注射感染W(wǎng)SSV后3h時(shí)，在螯蝦鰓、血淋巴、附肢和造血組織中檢測(cè)到WSSV，預(yù)示著WSSV可能是通過(guò)血淋巴傳播到其他組織中；感染后12h時(shí)，在肌肉和心臟組織中檢測(cè)到WSSV，并且在整個(gè)感染過(guò)程中WSSV濃度偏低，尤其肌肉中的WSSV濃度是所有樣品組織中最低的，說(shuō)明肌肉和心臟組織不是WSSV主要的靶器官。比較各組織中WSSV濃度，發(fā)現(xiàn)在感染后24h內(nèi)，鰓組織中WSSV濃度最高，附肢和血淋巴次之但高于其他組織，肌肉中WSSV濃度最低。Tang等報(bào)道在感染早期凡納濱對(duì)蝦血

淋巴中WSSV濃度也較高[13]。在感染后36～72h時(shí)，附肢中WSSV濃度最高，血淋巴、鰓、心臟與造血組織次之，肌肉中WSSV濃度最低。通過(guò)檢測(cè)瀕臨死亡或剛剛死亡螯蝦組織中WSSV濃度，發(fā)現(xiàn)附肢中WSSV濃度中最高，血淋巴、鰓、心臟和造血組織稍低，肌肉中WSSV濃度最低，這些數(shù)據(jù)可以為WSSV檢測(cè)及感染進(jìn)程判斷提供參考。

從本文結(jié)果可以看出，血淋巴可能在WSSV體內(nèi)組織間傳播中起了重要作用，WSSV隨著血淋巴循環(huán)到達(dá)其它組織，造成對(duì)其它組織的感染。因附肢、鰓、血淋巴易于取樣，且病毒在這些組織中增殖變化趨勢(shì)較一致，代表了WSSV增殖規(guī)律，是很好的病毒檢測(cè)與病程進(jìn)展評(píng)估材料。

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Analysis on Dynamic Changes of WSSV Amount in Procambarus clarkii through Quantitative Real-time PCR

Zhang Ling，Tang Xiaoqian，Sheng Xiuzhen，Zhan Wenbin
（Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao，Shadong 266003）

A real-time quantitative PCR was developed and the absolute copy number of WSSV VP28 gene was quantified based on a standard curve in Procambarus clarkii infected with WSSV. Following intramuscular injection with WSSV，the gill，hemolymph，heart，muscle，pleopods and hemopoietic tissue of Procambarus clarkii were sampled at 0，3，6，12，24，36，48，60 and 72 h post infection（hpi），DNA was extracted from the samples and the viral load was analyzed. It was found that WSSV was detected in pleopod，gill hemolymph and hemopoietic tissue at 3 hpi，and in all sampled tissues at 12hpi with low absolute copy number of WSSV；then the WSSV copies increased logarithmically from 24 to 48hpi and a low mortality rate was observed. Thereafter，the WSSV propagation went into the plateau phase and massive mortality appeared from 60 to 72hpi，showing a positive correlation between the viral load and cumulative mortality of Procambarus clarkii. Obvious difference in WSSV copy numbers were found in tested tissues，and WSSV copies in pleopod were the highest，followed by hemolymph，gill，heart and hemopoietic tissue，and the lowest in muscle. The dynamic changes of the amount of WSSV in pleopods could well represent all sampled tissues of Procambarus clarkii，so pleopods could be a reliable tissue for WSSV detection. This study might provide technical support for early diagnosis of WSSV infection and important basic data for better understanding of WSSV proliferation rules in shrimp.

Procambarus clarkii；white spot syndrome virus；quantitative real-time PCR；virus proliferation

S941.41+9；S945.4

A

1005-944X（2015）06-0069-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD17B01）、公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201103034）和山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014GNC111015）資助。

繩秀珍