洋地黃毒苷對肺癌NCI-H446與A549細胞增殖和周期的影響

劉 鋒，陳志添，邵孔健，薩本仲

（福州市第二醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 350007）

洋地黃毒苷對肺癌NCI-H446與A549細胞增殖和周期的影響

劉 鋒，陳志添，邵孔健，薩本仲

（福州市第二醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 350007）

肺癌是全球癌癥導(dǎo)致死亡中最常見的病因，80%的肺癌屬于非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC），而70%的NSCLC確診時已為晚期，常規(guī)化療藥物在治療肺癌過程中易產(chǎn)生多藥耐藥性，尋找新靶向藥物治療肺癌愈發(fā)迫切［1］。1999年Haux等［2］對9 000多例因心臟疾患使用洋地黃毒苷的患者進行了藥物療效分析，證實血液中洋地黃毒苷的較高濃度與血液和泌尿系統(tǒng)腫瘤較低發(fā)生率相關(guān)聯(lián)，洋地黃毒苷血漿濃度小于21 nmol/L的患者腫瘤發(fā)生率是血漿濃度在21～29 nmol/L患者的3.3倍。這提示心臟疾病患者服用洋地黃毒苷后，其正常血漿濃度即可抑制腫瘤細胞增殖，洋地黃毒苷可在低于導(dǎo)致心臟毒性的濃度下發(fā)揮抑制腫瘤的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)洋地黃毒苷在體外抑制人肝癌、前列腺癌、白血病等多種腫瘤細胞增殖［4-6］，誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。但對強心苷藥物洋地黃毒苷發(fā)揮抗腫瘤作用的機制尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)肺癌NCI-H446和A549細胞，采用不同濃度洋地黃毒苷作用于2種細胞后，探討洋地黃毒苷對肺癌NCIH446和A549細胞增殖和周期的影響，從細胞周期調(diào)控蛋白表達變化初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人肺癌NCI-H446與A549細胞均購自于中國科學(xué)院上海細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購自天津市灝洋生物制品公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍（methylthiazolyl-diphenyltetrazolium bromide，MTT）為Sigma公司產(chǎn)品；洋地黃毒苷（購自美國Sigma公司，純度＞99.9%，用DMSO溶解，配成10μ mol/L貯存液，過濾后分裝，-20℃ 保存?zhèn)溆茫涣呀庖?、蛋白濃度測定試劑盒、細胞周期檢測試劑盒和化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人Cyclin A 1、P21單克隆抗體購于Santa C ruz公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肺癌NCI-H446與A549細胞分別接種于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細胞匯合率達到70%～80%進行細胞傳代，先用PBS漂洗細胞后加入0.25%胰酶（含0.01% EDTA）消化細胞，再用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將細胞從瓶壁上洗脫，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞用于試驗。

1.3 MTT法測定洋地黃毒苷對細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期人肺癌NCI-H446與A549細胞，分別用胰酶消化，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5× 104/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μ L。在37 ℃ 、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液180 μL及藥液20 μL。取出用DMSO溶解配制的洋地黃毒苷母液，用培養(yǎng)液稀釋至終濃度為10、20、40、80、160 nmol/L。每個藥物濃度平行設(shè)4孔，同時設(shè)置對照組，對照組中每孔加入20 μL的PRMI-1640培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入5mg/mL的MTT 20 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型震蕩器上搖勻15 min，待結(jié)晶完全溶解，放入酶標(biāo)儀中測定490nm波長處吸光度值。計算藥物對腫瘤細胞的增殖抑制率。

1.4 流式細胞術(shù)測定洋地黃毒苷對細胞周期的影響

取對數(shù)生長期的人肺癌NCI-H446與A549細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清PRMI-1640培養(yǎng)液制備濃度為4.0×104/mL的細胞懸液，接種于50 mL細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶接種5 mL。培養(yǎng)過夜后，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液及洋地黃毒苷藥液，使其終濃度為10、40、160 nmol/L，同時設(shè)置對照組，對照組加入相同體積的細胞培養(yǎng)液。在給藥后24 h，消化離心收集細胞，PBS洗2次，細胞沉淀用70%乙醇懸浮，在-20 ℃冰箱固定24 h。PBS離心洗去乙醇后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（含50mg/L PI，10 mg/L RNaseA，0.1% TritonX-100，0.1%檸檬酸鈉和0.5% NaCl），室溫下避光染色30min，400目篩網(wǎng)過濾，用流式細胞儀檢測DNA含量，分析細胞周期（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長630 nm）。

1.5 Western blot 檢測洋地黃毒苷對細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

對于貼壁的人肺癌NCI-H446與A549細胞分別先用預(yù)冷的PBS潤洗3次，加入200 μL 細胞裂解液與苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，終濃度100 μg/mL）混合液，放置于冰上裂解10 min，提取細胞總蛋白。用BCA法進行蛋白定量。加入加樣緩沖液，沸水煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜用含50 mg/mL BSA的TBST室溫封閉3 h，一抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min；加入相對應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10min；用化學(xué)發(fā)光法檢測Cyclin A1和P21蛋白的表達情況，置于多功能凝膠成像儀掃描分析印跡條帶光密度值。目的蛋白相對表達量用目的條帶光密度值與內(nèi)參β-acitn蛋白光密度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 洋地黃毒苷對人肺癌NCI-H446和A549細胞增殖的影響

不同濃度洋地黃毒苷（10、20、40、80和160n mol/L）對肺癌NCI-H446和A549細胞增殖均有明顯抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，對細胞增殖抑制的效果越來越明顯，呈現(xiàn)時間和濃度依賴性（P＜0.05）。洋地黃毒苷分別作用肺癌NCI-H446和A549細胞48 h后，半數(shù)抑制濃度IC50值依次為61.26 和110.73nmol/L。與A549細胞相比，NCI-H446細胞株表現(xiàn)為對洋地黃毒苷的增殖抑制作用更為敏感。

2.2 洋地黃毒苷對人肺癌NCI-H446和A549細胞周期的影響

洋地黃毒苷對人肺癌NCI-H446和A549細胞周期各時期DNA含量的影響如圖2和表1所示。洋地黃毒苷能使細胞周期阻滯于S期。隨著洋地黃毒苷藥物作用濃度的增加，在NCI-H446與A549細胞中，分別與對照組相比，G1/G0期細胞周期比例顯著下降（P＜0.05）， S期細胞周期比例顯著上升（P＜0.05），而G2/M期細胞周期變化不明顯（P＞0.05）。

2.3 洋地黃毒苷對細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達的影響

洋地黃毒苷對NCI-H446和A549細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin A1和P21表達的影響如圖3所示：隨著洋地黃毒苷作用濃度的增加，Cyclin A1蛋白表達水平均出現(xiàn)下降，與對照組相比，洋地黃毒苷能顯著抑制Cyclin A1的表達（P＜0.05）；而P21蛋白表達水平隨著洋地黃毒苷作用濃度的增加而出現(xiàn)上升，與對照組相比，洋地黃毒苷能顯著提高P21蛋白的表達（P＜ 0.05）， 并呈濃度依賴性。

3 討 論

近些年來的研究發(fā)現(xiàn)強心苷類固醇（cardiotonic sterroids，CTS）對人的多種惡性腫瘤如肝癌、前列腺癌、白血病和非小細胞肺癌細胞等具有廣譜及高選擇性抗腫瘤活性，而對人的正常細胞殺傷作用極弱［3-6］。在Johnasond等［4］的研究中，哇巴因誘導(dǎo)人前列腺癌細胞系PC23凋亡的IC50為0.152 μmol/L， 而誘導(dǎo)良性增生的前列腺細胞系BPH21凋亡的IC50＞100μ mol/L。目前臨床常用的化療藥物大多對腫瘤細胞和正常細胞沒有顯著的選擇性，而CTS由于對腫瘤細胞的選擇性細胞毒效果而使其將有可能發(fā)展成為一類重要的抗腫瘤藥物。

洋地黃毒苷作為正性肌力藥物，臨床上用于治療心力衰竭和心房顫動已有200多年的歷史，藥理學(xué)背景非常清楚，安全血漿藥物濃度高。已有多項研究發(fā)現(xiàn)其在安全血漿藥物濃度內(nèi)可以有效抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。如Hallbook等［7］研究了洋地黃毒苷、地高辛和哇巴因的抗白血病作用，發(fā)現(xiàn)洋地黃毒苷效果最好，特別是對來自病人的B-precursor ALL 和T-ALL細胞非常敏感，IC50值在安全血漿濃度范圍內(nèi)。Lopez-lazaro等［6］研究了洋地黃毒甙和地高辛等對腎上腺癌細胞株TK-10等3種腫瘤細胞株的抑增殖作用，發(fā)現(xiàn)洋地黃毒甙的IC50值在3～33 nmol/L之間，低于其治療慢性心功能障礙的有效血漿濃度。Elbaz等認(rèn)為，洋地黃毒苷及其類似物可能將成為一類新型的抗腫瘤藥物［8］。

在細胞周期運行中，參與調(diào)控的蛋白主要包括3種：細胞周期蛋白（Cyclin）、周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）及周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）。其中Cyclin及CDK為正性調(diào)節(jié)蛋白，CKI為負性調(diào)控蛋白，調(diào)控因子在G1/S、G2/M兩個關(guān)鍵限制點進行調(diào)控［9］。而幾乎所有腫瘤細胞都存在細胞周期調(diào)控機制的破壞而導(dǎo)致細胞生長失控，大多數(shù)抗腫瘤藥物可以使細胞周期阻滯于G1期、S期或G2/M期。研究發(fā)現(xiàn)，CTS也能通過干預(yù)腫瘤細胞周期進程，而抑制腫瘤細胞的增殖，不可逆的引起細胞生長停滯［10］。

Xu等［6］將哇巴因、蟾毒素體外作用于人肝癌HepG-2和SMMC-7721細胞，能顯著性抑制細胞增殖，腫瘤細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，細胞發(fā)生明顯凋亡，呈現(xiàn)時間、濃度依賴性。流式細胞儀檢測分析，肝癌細胞周期被阻滯于S期。在岳瑤等［11］的研究中，100 nmol/L 布法林作用于人胃癌MGC-803細胞48 h，G2/M期細胞所占比率由對照組的12.18%增至53.19%，其機制與周期負調(diào)控因子p16、p21和pRb蛋白表達上調(diào)有關(guān)。也有報道布法林可引起人卵巢腫瘤細胞G0/G1周期阻 滯［12］，提示CTS作用于不同的細胞系可能影響不同控制點造成細胞周期阻滯。在本實驗中，使用流式細胞儀檢測肺癌NCI-H446和A549細胞周期分布情況，結(jié)果顯示，隨著藥物作用濃度的增加，G1/G0期細胞所占比例出現(xiàn)下降，而S期細胞所占比例出現(xiàn)顯著性上升，人肺癌NCI-H446和A549細胞發(fā)生S期阻滯。

在細胞增殖與調(diào)控的過程中，正性調(diào)節(jié)因子Cyclin A1與負性調(diào)控因子P21蛋白扮演著重要作用。Cyclin A1屬S期和M期周期蛋白，可分別與CDK2和CDK1結(jié)合。實驗表明，Cyclin A1/CDK2可以激活DNA 聚合酶α，在S期能促進DNA合成與染色體復(fù)制，進而促使細胞越過G2/M期轉(zhuǎn)折點，進入M期［13］。P21是一種周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子，Cyclin、CDK 和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）是它發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。當(dāng)DNA損傷或細胞衰老時，p53增加并誘導(dǎo)p21轉(zhuǎn)錄，p21與相應(yīng)的CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制蛋白激酶的活性，阻滯細胞周期［14］。本研究觀察了不同濃度洋地黃毒苷對周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin A1、P21表達的影響。結(jié)果表明，隨著藥物作用濃度的增加，正性調(diào)控因子Cyclin A1表達量明顯下調(diào)，而負性調(diào)控因子P21蛋白表達水平明顯上升，并呈濃度依賴性。

綜上所述，洋地黃毒苷對人肺癌NCI-H446和A549細胞的增殖有顯著性抑制作用，并能明顯影響細胞周期時相分布，使NCI-H446和A549細胞阻滯于S期。初步推斷，對S期調(diào)控相關(guān)的正性（Cyclin A1）、負性（P21）調(diào)節(jié)因子表達水平同時發(fā)揮干預(yù)效應(yīng)，可能是洋地黃毒苷對人肺癌NCI-H446和A549細胞發(fā)揮S期阻滯、影響細胞增殖的分子機制之一。

［1］ De Santis C，Ma J，Bryan L，et al. Breast cancer statistics，2013［J］. CA Cancer J Clin，2014，64（1）：52-62.

［2］ Haux J. Digitoxin is a potential anticancer agent for several types of cancer［J］. Med Hypoth，1999，53（2）：543-548.

［3］ Mijatovic T，Van Quaquebeke E，Delest B，et al. Cardiotonic steroids on the road to anti-cancer therapy［J］. Biochim Biophys Acta，2007，1776（1）：32-57.

［4］ Johnson PH，Walker RP，Jones SW，et al. Multiplex gene expression analysis for high-throughput drug discovery：screening and analysis of compounds affecting genes overexpressed in cancer cells［J］. Mol Cancer Ther，2002，1（14）：1293-1304.

［5］ Lopez-Lazaro M，Pastor N，Azrak SS，et al. Digitoxin，at concentrations commonly found in the plasma of cardiac patients，antagonizes etoposide and idarubicin activity in K562leukemia cells［J］. Leuk Res，2006，30（7）：895-898.

［6］ Xu ZW，Wang FM，Gao MJ，et al. Cardiotonic steroids attenuate ERK phosphorylation and generate cell cycle arrest to block human hepatoma cell growth［J］. J Steroid Biochem Mol Biol，2011，125（3/4/5）：181-191.

［7］ Hallbook H，F(xiàn)elth J，Eriksson A，et al. Ex vivo activity of cardiac glycosides in acute leukaemia［J］. PLoS One，2011，6（1）：e15718.

［8］ Elbaz HA，Stueckle TA，Tse W，et al. Digitoxin and its analogs as novel cancer therapeutics［J］. Exp Hematol Oncol，2012，1（1）：4.

［9］ Moore MJ，Wang Q，Kennedy CJ，et al. An alternative splicing network links cell-cycle control to apoptosis［J］. Cell，2010，142（4）：625-636.

［10］ Chang LJ，Eastman A. Differential regulation of p21 （waf1）protein half-life by DNA damage and Nutlin-3 in p53 wild-type tumors and its therapeutic implications［J］. Cancer Biol Ther，2012，13（11）：1047-1057.

［11］ 岳瑤，劉云鵬，侯科佐，等. 蟾蜍靈對胃癌組織MGC-803細胞周期作用機制的研究［J］. 腫瘤防治雜志，2005，12（6）：409-412.

［12］ Takai N，Ueda T，Nishida M，et al. Bufalin induces growth inhibition，cell cycle arrest and apoptosis in human endometrial and ovarian cancer cells［J］. Int J Mol Med，2008，21（5）：637-643.

［13］ Muller-Tidow C，Ji P，Diederichs S，et al. The cyclin A1-CDK2 complex regulates DNA double-strand break repair［J］. Mol Cell Biol，2004，24（20）：8917-8928.

［14］ Abbas T，Dutta A. p21 in cancer：intricate networks and multiple activities［J］. Nat Rev Cancer，2009，9（6）：400-414.

Effect of digitoxin on proliferation and cell cycle of NCI-H446 and A549 cells

LIU Feng，CHEN Zhitian，SHAO Kongjian，SA Benzhong
（Department of Hepatobiliary Surgery， The Second Hospital of Fuzhou， Fuzhou 350007， Fujian， China）

目的： 探討洋地黃毒苷對肺癌NCI-H446與A549細胞增殖和細胞周期的影響，并初步探討其可能的作用機制。方法：體外培養(yǎng)的NCI-H446與A549細胞分別經(jīng)不同濃度（10、20、40、80、160 nmol/L）的洋地黃毒苷處理24、48和72 h后，采用MTT法檢測細胞增殖情況，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測洋地黃毒苷處理細胞48 h后各組細胞周期分布，Western blot檢測細胞中Cyclin A和P21蛋白表達水平。結(jié)果：與未經(jīng)洋地黃毒苷處理的對照組相比，不同濃度（10、20、40、80和160 nmol/L）的洋地黃毒苷均可抑制 NCI-H446與A549細胞的增殖， 均呈劑量和時間依賴性（P＜0.05），作用48 h后，洋地黃毒苷對NCI-H446與A549細胞的IC50值分別為61.26 nmol/L和110.73 nmol/L。流式細胞儀分析結(jié)果顯示，隨藥物作用濃度增加，G0/G1細胞比例降低，S期細胞比例顯著增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot分析結(jié)果顯示，洋地黃毒苷能劑量依賴性的下調(diào)Cyclin A1蛋白表達和上調(diào)P21 蛋白的表達（P＜0.05）。結(jié)論：洋地黃毒苷可抑制體外培養(yǎng)的肺癌NCI-H446與A549細胞增殖，誘導(dǎo)細胞發(fā)生S期阻滯，其機制可能與細胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達有關(guān)。

洋地黃毒苷；肺癌；細胞周期調(diào)控；細胞周期蛋白A1

OBJECTIVE:To investigate the effects of digitoxin on proliferation and cell cycle of human lung cancer cell lines NCI-H446 and A549，and to explore its possible mechanisms.METHODS：NCI-H446 and A549 cells were treated with digitoxin at different concentrations（10，20，40，80 and 160 nmol/L）. The effect on proliferation of NCI-H446 and A549 cells were detected by MTT assay. Flow cytometry was used to test the cell cycle distribution of NCIH446 and A549 cells. Protein expressions of Cyclin A1 and P21 in NCI-H446 and A549 cells were evaluated by Western blot.RESULTS：As compared with control group，cell proliferation was inhibited by digitoxin in a dose- and timedependent manner（P＜0.05），the IC50value for digotoxin were 61.26 nmol/L in NCI-H446 and 110.73 nmol/L in A549 at 48 h. After 48 h treatment，the proportion of NCI-H446 and A549 cells in G0/G1 phase was decreased，while the proportion in S phase was increased. Western blot analysis showed that digitoxin could significantly up-regulate the expression of Cyclin A1 and down-regulate the expression of P21 in a dose-dependent way（P＜0.05）.CONCLUSION：Digitoxin could exert an the anti-proliferative effect on NCI-H446 and A549 cells and induce S phase arrest in vitro. The mechanism may be related to the expressions of proteins associated with cell cycle.

digitoxin；lung cancer；regulation of cell cycle；Cyclin A1

R734.2

A

1004-616X（2015）01-0006-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.002

2014-07-14；

2014-10-21

福州市科技計劃項目（2011-S-67-4）

作者信息： 劉 鋒，E-mail：508788420@qq.com； Tel：18046041710