光氣中毒致肺泡上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷的研究

龍 子，孔德欽，海春旭，*，王 欣，*

（1. 第 四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅四營(yíng)十三連，陜西 西安 710032；2. 第 四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032）

光氣中毒致肺泡上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷的研究

龍 子1，孔德欽2，海春旭2，*，王 欣2，*

（1. 第 四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅四營(yíng)十三連，陜西 西安 710032；2. 第 四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032）

光氣作為一種無(wú)色窒息性化學(xué)毒劑，又名碳酰氯或二氯碳酰，分子式為COCl2，是重要的軍用化學(xué)戰(zhàn)劑［1］。 光氣也是一些化工產(chǎn)品合成的重要原料，廣泛用于農(nóng)藥、制藥、塑料、涂料、染料及紡織品等生產(chǎn)領(lǐng)域中。由于其揮發(fā)溫度低（7.9 ℃）、反應(yīng)快速、分散度高等特點(diǎn)，在生產(chǎn)、運(yùn)輸、管理過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)意外泄漏，如若防護(hù)不當(dāng)，常可導(dǎo)致人員中毒及傷亡的嚴(yán)重公共事件。肺臟是光氣攻擊損害的主要靶器官，大劑量光氣中毒可造成動(dòng)物急性肺損傷、肺水腫，嚴(yán)重時(shí)發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征，導(dǎo)致光氣中毒死亡［2-4］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的一種非常重要的細(xì)胞器，在能量代謝和信號(hào)通路傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用［5-6］。本研究中我們通過(guò)構(gòu)建光氣中毒大鼠模型，探討光氣中毒對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（軍）2013-0008。光氣由本教研室化學(xué)方法（40%固體三光氣溶于環(huán)已烷，二甲基甲酰胺滴定產(chǎn)生）制備。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。戊巴比妥鈉、NADH、牛血清白蛋白（BSA）和三磷酸腺苷（ATP）等購(gòu)自Sigma公司。其他常規(guī)試劑為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及染毒方法 30只SD大鼠（SPF級(jí)），雄性，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和染毒組，每組15只。正常對(duì)照組以空氣為對(duì)照。根據(jù)課題組以往的研究基礎(chǔ)［7-8］，染毒組給予光氣動(dòng)態(tài)染毒（10 g/m3），染毒5 min，構(gòu)建光氣致急性肺損傷模型。動(dòng)物于染毒后2 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，處死全部大鼠，分別采集樣本進(jìn)行檢測(cè)。將其中6只大鼠的整個(gè)肺離體后立即稱濕重，80 ℃烘干48 h后稱干重，計(jì)算濕/干比。

1.2.2 HE染色檢測(cè) 取余下9只大鼠的左肺上葉，漂浮固定于10%中性緩沖福爾馬林液中48 h后常規(guī)脫水、透明、包埋，在Leica RM2135型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上制備4μm切片，進(jìn)行HE染色。

1.2.3 透射電鏡觀察 取9只大鼠左肺下葉，組織塊約1 mm3大小，加入3%戊二醛4 ℃固定3 h，交由電鏡室制作透射電鏡標(biāo)本。鏡下觀察、拍照，重點(diǎn)觀察線粒體微觀改變。電鏡下對(duì)肺泡上皮細(xì)胞線粒體進(jìn)行半定量分析。相同放大倍數(shù)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野照相，每個(gè)視野中隨機(jī)選取約20個(gè)線粒體進(jìn)行分析。每只動(dòng)物對(duì)100個(gè)線粒體進(jìn)行分析。按照線粒體的受損程度，逐個(gè)將線粒體進(jìn)行0～4級(jí)記分（級(jí)別越高損傷程度越重），最后計(jì)算平均分?jǐn)?shù)。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為正常；1分為結(jié)構(gòu)基本正常，基質(zhì)顆粒丟失（輕度腫脹，基質(zhì)密度減少，嵴分離）；2分為線粒體腫脹（基質(zhì)密度嚴(yán)重減小，嵴分離），基質(zhì)透明，嵴未斷裂；3分為線粒體嵴斷裂，基質(zhì)凝固（嚴(yán)重腫脹）；4分為內(nèi)外膜完整消失，呈空泡狀（嚴(yán)重腫脹伴嵴斷裂，內(nèi)外膜破裂）。

1.2.4 制備肺臟組織線粒體懸液 采用改良的分離介質(zhì)，迅速取出9只大鼠的右肺組織，按1∶9（m/V）加入帶有冰渣的分離介質(zhì)（0.25 mol/L蔗糖，0.05 mol/L甘露醇，1 mmol/L 乙二胺四乙酸，10 mmol/L 氨基丁醇，pH 7.5），電動(dòng)勻漿器勻漿（5 000 r/min離心1 min），制成10%的肺組織勻漿液。然后將勻漿液于600 r/min低速離心10 min，取上清；再以1 600 r/min離心5min，取上清；最后12 500 r/min離心10 min，留沉淀，即為線粒體；沉淀用分離介質(zhì)5 mL再次懸浮，12 500r/min離心10 min后得到的沉淀為提純的線粒體。往沉淀中加入1 mL分離介質(zhì)制成線粒體懸液，用BCA法測(cè)定蛋白含量。

1.2.5 線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活力測(cè)定 所有測(cè)定均在25 ℃條件下進(jìn)行，用酶促一級(jí)反應(yīng)的初速度來(lái)計(jì)算酶活力［9］。①?gòu)?fù)合物I的測(cè)定：在樣品杯中加入0.2mol/L，pH7.4的PBS 1.5 mL，10 mmol/L鐵氰化鉀0.3mL，線粒體懸浮液0.03 mL，0.1 mol/L氰化鉀0.05mL，用雙蒸水補(bǔ)充體積至2.97 mL，加入0.1 mol/L NADH （用10 mmol/L Tris配制） 30 μL作為起動(dòng)劑，在420 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)?？瞻妆杏猛w積分離介質(zhì)代替線粒體懸浮液，不加NADH，其余加入試劑均同樣品杯。單位定義：每毫克線粒體蛋白每分鐘消耗的NADH的物質(zhì)的量。氧化型輔酶I的克分子消光系數(shù)E420=1.033 mmol/（L·cm）。②復(fù)合物II的測(cè)定：根據(jù)2，6-二氯酚靛酚鈉鹽在600 n m處吸光度的減少進(jìn)行測(cè)定。肺組織勻漿懸于25 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.5）中，分別在不同濃度的琥珀酸鹽、加入艾地苯醌或吩嗪硫酸甲酯作為電子受體、不同濃度的艾地苯醌、加入或不加常用的佐劑——BSA和ATP這4種條件下進(jìn)行測(cè)定。從加入艾地苯醌反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行，3 min內(nèi)吸光度持續(xù)下降，復(fù)合物II活性的特異性通過(guò)加入特異性抑制劑丙二酸（5 mmol/L） 或 2-噻吩甲酰三氟丙酮（500μmol/L） 后的抑制率來(lái)測(cè)量。③復(fù)合物 II+III的測(cè)定：在樣品杯中加入0.2 mol/L， pH7.4的PBS 1.5 mL，3mmol/L EDTA-K 0.3 mL，0.1 mmol/L氧化型細(xì)胞色素C（cytC） 0.1 mL，0.1 mol/L氰化鉀0.05 mL，線粒體懸浮液0.03 mL，用雙蒸水補(bǔ)充體積至2.97 mL，加入0.1mol/L NADH （用10 mmol/L Tris配制） 30 μL作為起動(dòng)劑，在550 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，空白杯中用同體積分離介質(zhì)代替線粒體懸浮液，除不加NADH外其余加入試劑均同樣品杯，單位定義：每毫克線粒體蛋白每分鐘還原cytC的物質(zhì)的量。復(fù)合物II+III的活性減去復(fù)合物II的活性，即得復(fù)合物III的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 光氣染毒后肺濕/干比值的變化

光氣染毒2 h后，與陰性對(duì)照組相比，光氣染毒組大鼠的肺濕/干比值明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

2.2 光鏡下肺臟HE染色觀察

肺組織HE染色檢查結(jié)果如圖2。陰性對(duì)照組大鼠細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)和肺臟未見(jiàn)異常。肺泡腔中無(wú)紅細(xì)胞滲出，肺泡腔與肺泡隔完整（圖2A）。與對(duì)照組相比，光氣染毒后，大鼠肺泡腔可見(jiàn)大片出血樣改變，大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞聚集于肺泡壁周?chē)?，肺泡壁增厚，肺泡壁邊緣不?guī)整，肺泡腔有明顯的滲出物樣物質(zhì)，血管內(nèi)有許多凝聚的細(xì)胞（圖2B）。

2.3 肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察

光氣染毒后，透射電鏡觀察結(jié)果顯示：正常對(duì)照組，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體輪廓正常，基質(zhì)密度致密、均勻；線粒體嵴完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列有序（圖3A和B）。I型肺泡上皮細(xì)胞表面光滑、氣血屏障結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔未見(jiàn)明顯的紅細(xì)胞和滲出物（圖3C和D）。正常對(duì)照組線粒體損傷評(píng)分為0分。

光氣染毒組肺Ⅰ型細(xì)胞表面不完整，基質(zhì)出現(xiàn)大小不等的空泡，細(xì)胞核邊集，出現(xiàn)凋亡樣改變（圖4A）。肺Ⅱ型細(xì)胞核邊集，線粒體變少，形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)滲出物。部分線粒體內(nèi)膜完整性消失，基質(zhì)透明，多數(shù)線粒體呈空泡狀，嚴(yán)重腫脹伴嵴斷裂，內(nèi)膜破裂，線粒體損傷評(píng)分為4分（圖4B和C）。腔內(nèi)泡狀突起減少（或消失），肺組織充血與水腫明顯，氣血屏障受損，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，排列紊亂（圖4D）。腔內(nèi)可見(jiàn)大量纖維狀滲出物，氣血屏障受損（圖4E）。線粒體嚴(yán)重腫脹、嵴斷裂，部分呈現(xiàn)空泡狀，排列紊亂，基質(zhì)凝固，線粒體損傷評(píng)分為4分，同時(shí)，板層小體呈巨大空泡樣變化（3分）（圖4F）。染毒組肺組織線粒體損傷評(píng)分為（3.7±0.5）分。

2.4 線粒體復(fù)合物活性

在光氣染毒2 h后，測(cè)定肺組織線粒體氧化呼吸鏈酶復(fù)合物的活性，反映細(xì)胞的呼吸鏈功能發(fā)生的變化。與陰性對(duì)照組相比，光氣染毒組線粒體復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅱ和復(fù)合物Ⅲ活性均明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討 論

光氣是一種窒息性劇毒氣體，吸入后主要通過(guò)導(dǎo)致肺水腫引起中毒。目前，光氣導(dǎo)致肺水腫的機(jī)制還不完全清楚［10］，其中毒主要有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①毒性作用特別強(qiáng)，往往能夠引起嚴(yán)重的急性呼吸道損傷，特別是導(dǎo)致肺水腫，造成急性呼吸窘迫綜合征［11］；②反應(yīng)速度特別快，在很短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生毒性，一般不具有遺傳毒性和致癌性；③分散度較高，使其在空氣中漂浮時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致接觸暴露的機(jī)會(huì)增加，發(fā)生中毒的概率增加；④軍民兩用，光氣作為化工原料、產(chǎn)品或副產(chǎn)物廣泛存在于生活和生產(chǎn)中，突發(fā)事故或恐怖活動(dòng)都可以導(dǎo)致光氣中毒［12］；⑤防治困難，目前光氣中毒還缺乏有效的救治藥物，迫切需要尋找新的中毒靶點(diǎn)，指導(dǎo)有效藥物的研發(fā)［10］。

本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，繼發(fā)氧化損傷在光氣中毒中發(fā)揮重要作用［13］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的一種非常重要的細(xì)胞器，在能量代謝和信號(hào)通路傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧生成的主要部位，也是氧化損傷的主要靶點(diǎn)［14］。本文重點(diǎn)研究了光氣對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，光氣染毒后，不僅存在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，更重要的是肺Ⅰ型、Ⅱ型上皮細(xì)胞受到破壞損傷，透射電鏡檢測(cè)可以看到，線粒體明顯腫脹，形態(tài)改變，甚至固縮溶解，數(shù)量減少，線粒體嵴斷裂和缺失；線粒體復(fù)合物受損，活性降低，表明光氣中毒后的毒性作用靶點(diǎn)是線粒體，出現(xiàn)了線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常。本課題組以往研究已發(fā)現(xiàn)，光氣中毒可以導(dǎo)致線粒體ATP酶活性降低［15］。綜上所述，光氣導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，引起ATP合成障礙，細(xì)胞的穩(wěn)定性、順應(yīng)性降低，嚴(yán)重破壞細(xì)胞的修復(fù)功能，如不能及時(shí)阻斷，就會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地導(dǎo)致動(dòng)物肺組織壞死，失去功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷為光氣中毒損傷的主要毒作用靶點(diǎn)，為光氣中毒防治提供了新思路。

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Study on phosgene-induced damage of pulmonary mitochondria

LONG Zi1，KONG Deqin2，HAI Chunxu2，*，WANG Xin2，*
（1. The Thirteenth Company， the Fourth Battalion， First Brigade，F(xiàn)ourth Military Medical University， Xi’an 710032； 2. Shaanxi Key Lab of Free Radical Biology and Medicine， Department of Toxicology， School of Preventive Medicine， Fourth Military Medical University， Xi’an 710032， Shaanxi， China）

目的： 研究光氣中毒對(duì)肺泡上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損傷作用。方法：30只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和染毒組，每組各15只。正常對(duì)照組以空氣為對(duì)照。染毒組給予光氣（10 g/m3）動(dòng)態(tài)染毒5 min，構(gòu)建光氣致急性肺損傷模型。染毒后2 h麻醉，采集肺組織樣本，測(cè)定肺組織濕/干比，進(jìn)行肺組織病理檢測(cè)和電鏡觀察，并測(cè)定肺組織線粒體酶復(fù)合物活性。結(jié)果：與對(duì)照組比較，光氣染毒后，肺濕/干比顯著增加（P＜0.01），肺組織存在炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡上皮細(xì)胞損傷；線粒體明顯腫脹，形態(tài)改變，甚至固縮溶解，數(shù)量減少，線粒體嵴斷裂和缺失，線粒體酶復(fù)合體活性降低（P＜0.05）。結(jié)論：肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷為光氣中毒的主要毒作用靶點(diǎn)之一，本研究結(jié)果為光氣中毒防治提供了新思路。

光氣；急性肺損傷；線粒體；中毒

OBJECTIVE:To study the toxicological effects of phosgene on pulmonary mitochondria.METHODS：30 SD rats were randomly divided into two groups，with 15 in each group. The rats in control group were exposed to air. The rats in phosgene group were exposed to 10 g/m3phosgene for 5 min. Two hours after exposure，pulmonary tissues were collected，HE staining and transmission electron microscope were used to identify histological changes. Activities of mitochondrial complexes were determined.RESULTS：Phosgene induced a significant increase of pulmonary wet/dry ratio. After phosgene poisoning，there were profuse neutrophil infiltration and pulmonary alveoli epithelial cell damage. Mitochondria were notably swollen，and even appeared contracted and dissolved. The number of mitochondria was significantly decreased. Mitochondrial ridge was broken and absent. The activities of mitochondrial complex were significantly reduced.CONCLUSION：Mitochondria were main targets of phosgene poisoning，and the results provided basis for the development of new drugs in the treatment of phosgene poisoning.

phosgene；acute lung damage；mitochondria；poisoning

R994.7

A

1004-616X（2015）01-0054-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.012

2014-10-03；

2014-12-25

軍隊(duì)青年基金資助（13QNP124）

作者信息：龍 子，E-mail：zi_long11@163.com。*通信作者：海春旭，E-mail：Cx_hai@fmmu.edu.cn；王 欣，E-mail：x inwang@fmmu.edu.cn