抗炎因子TSG-6抑制兔耳瘢痕增生的實(shí)驗(yàn)研究

王 暉，李小靜，陳

抗炎因子TSG-6抑制兔耳瘢痕增生的實(shí)驗(yàn)研究

王 暉，李小靜，陳

目的通過建立兔耳增生性瘢痕模型，研究腫瘤壞死因子α刺激基因-6（TSG-6）在增生性瘢痕形成過程中的作用及機(jī)制。方法建立兔耳增生性瘢痕模型，右側(cè)耳創(chuàng)面為實(shí)驗(yàn)組，注射TSG-6，左側(cè)均注射等量PBS作為對(duì)照組，通過比較各組瘢痕指數(shù)（SEI）及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的不同來評(píng)價(jià)瘢痕增生程度的差異。采用免疫組化法及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在各組中的表達(dá)；以透射電鏡觀察及TUNEL法檢測瘢痕組織成纖維細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果與PBS對(duì)照組比較，TSG-6治療組炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)減少炎癥反應(yīng)明顯減輕，瘢痕組織成纖維細(xì)胞凋亡明顯增多，且SEI及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論抗炎因子TSG-6能明顯減弱增生性瘢痕的形成，其對(duì)瘢痕形成的抑制作用可能與抑制炎癥反應(yīng)及促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡相關(guān)。

動(dòng)物模型；增生性瘢痕；兔；炎癥；TSG-6

腫瘤壞死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6）是腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白-6（tumor necrosis factor alpha induced protein，TNFAIP6）的編碼基因，是在篩選腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）干預(yù)的人纖維細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，其表達(dá)可被TNF-α和白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等許多信號(hào)分子誘導(dǎo)［1－2］。由于基因啟動(dòng)子序列中存在激活物蛋白1和核因子白細(xì)胞介素結(jié)合位點(diǎn)，TNF-α、IL-1等促炎因子刺激后，該基因在成纖維細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，因此被認(rèn)為是一個(gè)受TNF-α調(diào)節(jié)的、參與多種炎性反應(yīng)的基因。TSG-6基因編碼蛋白含277個(gè)氨基酸，屬透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）結(jié)合蛋白家族，主要由相鄰的連接組件和CUB組件組成，可與HA、硫酸軟骨素、蛋白多糖以及蛋白聚糖的G1鏈結(jié)合［3］。Tan et al［4］實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗炎因子TSG-6在瘢痕疙瘩、正常瘢痕和無瘢痕皮膚中的差異分布。然而，TSG-6對(duì)瘢痕組織形成的影響未見報(bào)道。該研究以兔耳瘢痕模型為基礎(chǔ)觀察TSG-6局部創(chuàng)面注射對(duì)增生性瘢痕形成的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑rhTSG-6購于美國R＆D Systems公司，Ⅰ型、Ⅲ型膠原及TNF-α抗兔抗體購于美國Biorbyt公司，兔白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體、兔白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體購于美國Bioss公司，二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）購于美國Thermo Fisher Scientific公司，原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于美國Trevigen公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引物設(shè)計(jì)合成于上海捷瑞生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR擴(kuò)增試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 兔耳瘢痕模型的建立及用藥選用健康成年新西蘭大耳兔6只（購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），雌雄不拘，體重2.5～3.0 kg，分籠飼養(yǎng)。兔耳瘢痕模型的制作參照Morris et al［5］方法：用3%戊巴比妥鈉30 mg／kg進(jìn)行耳緣靜脈麻醉，嚴(yán)格無菌操作條件下，選取兔耳腹側(cè)面遠(yuǎn)離耳根部位無毛或少毛區(qū)，沿長軸避開可見血管，以角膜環(huán)鉆在兔耳腹側(cè)作直徑為7 mm創(chuàng)面，去除兔耳全層皮膚并刮除軟骨膜，每只兔耳作6個(gè)相同創(chuàng)面，共計(jì)72個(gè)創(chuàng)面，術(shù)后創(chuàng)面暴露。選擇兔右耳瘢痕作為TSG-6實(shí)驗(yàn)組，兔左耳瘢痕為PBS對(duì)照組。1 μg TSG-6予10 μl PBS溶解后用微量注射器分別于術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后5、10、15 d進(jìn)行右側(cè)耳創(chuàng)面局部注射，左側(cè)兔耳創(chuàng)面同時(shí)注射等量PBS作對(duì)照。術(shù)后26 d，3%戊巴比妥鈉做耳緣靜脈麻醉，切取標(biāo)本。用作HE、免疫組化染色的標(biāo)本置于4%中性甲醛中固定，其余均用深低溫冰箱－80℃保存。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 標(biāo)本行4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水；二甲苯透明；常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色；光鏡觀察并攝片。瘢痕增生程度以光鏡下測量的瘢痕指數(shù)（scar elevation index，SEI）［5］表示。

1.3.2 透射電鏡觀察 標(biāo)本行2.5%戊二醛4℃預(yù)固定2 h；PBS緩沖液漂洗3次；1%鋨酸4℃后固定2 h；常規(guī)電鏡樣品脫水、浸透、包埋、超薄切片和鈾鉛染色；透射電鏡觀察并照相。

1.3.3 免疫組化染色 各組兔耳病理性瘢痕組織石臘切片入梯度乙醇溶液中脫蠟；水化；PBS（pH 7.4）沖洗；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；枸櫞酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù)；小牛血清封閉；一抗分別為Ⅰ型、Ⅲ型膠原及TNF-α抗兔抗體和兔IL-1β抗體、兔IL-6抗體；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；中性樹膠封片。已知陽性片作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)操作參照原位凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行，基本步驟如下：各組兔耳病理性瘢痕組織石臘切片置于梯度乙醇溶液中脫蠟，水化，PBS（pH 7.4）沖洗，20 μg／ml蛋白水解酶K（10 mmol／L Tris／HCl，pH 7.4）室溫下消化30 min，PBS漂洗切片2次，吸干樣品周圍水分，滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照滴加50 μl標(biāo)記液），濕盒內(nèi)37℃避光孵育60 min；PBS漂洗玻片3次，樣品直接或封片后顯微鏡觀察。染色區(qū)域位于細(xì)胞核，光鏡下觀察正常的成纖維細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色，為陰性反應(yīng)，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈深淺不一的棕褐色，為陽性反應(yīng)，即凋亡細(xì)胞。在高倍鏡（× 400）視野下，每張切片選擇5個(gè)陽性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)成纖維細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比，即凋亡指數(shù)。

1.3.5 RT-PCR檢測炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá) 將凍存的瘢痕組織放入研缽中加入液氮研磨，加入TRIzol后經(jīng)過震蕩、離心將提取出的RNA沉淀溶于0.1%焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水中，用紫外分光光度計(jì)分別檢測260、280 nm處吸光度（absorbance，A）值（A260、A280），并計(jì)算RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明嚴(yán)格執(zhí)行。擴(kuò)增引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。

擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃終末延伸8 min，共35個(gè)循環(huán)。最終獲得產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析，測定條帶光密度值，以β-actin作比較計(jì)算炎癥因子相對(duì)mRNA比值，并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組之間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察術(shù)后3 d死亡1只，剩余5只，全部納入實(shí)驗(yàn)分析，創(chuàng)面均于術(shù)后12～14 d完全愈合，PBS對(duì)照組的30個(gè)創(chuàng)面模型中，術(shù)后21 d左右，瘢痕組織逐漸高出皮膚，呈現(xiàn)淡紅色，術(shù)后26 d，30個(gè)創(chuàng)面共形成增生性瘢痕24個(gè)，占80.0%，瘢痕增生明顯高出皮面且有攣縮現(xiàn)象。PBS對(duì)照組瘢痕塊顏色較紅，質(zhì)地較硬，瘢痕高出皮膚平面，增生范圍未超出原創(chuàng)緣；TSG-6實(shí)驗(yàn)組瘢痕顏色淡，質(zhì)地較柔軟。

2.2 TSG-6與瘢痕增生顯微鏡下用測微尺進(jìn)行測量并計(jì)算瘢痕指數(shù)，TSG-6實(shí)驗(yàn)組瘢痕指數(shù)為（1.92±0.15），PBS對(duì)照組瘢痕指數(shù)為（1.29± 0.18），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n＝12，t＝9.31，P＜0.01）。免疫組化染色結(jié)果顯示TSG-6實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積明顯較PBS對(duì)照組減輕。見圖1。

2.3 TSG-6與細(xì)胞凋亡透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察可見TSG-6實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡顯著，細(xì)胞內(nèi)可見核固縮線粒體腫脹及凋亡小體等，而PBS對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見明顯凋亡表現(xiàn)。見圖2。TUNEL半定量檢測分析發(fā)現(xiàn)TSG-6實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)為（0.42±0.05），明顯高于PBS對(duì)照組（0.30±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n＝12，t＝7.13，P＜0.01），見圖3。結(jié)果證實(shí)TSG-6實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡顯著。

2.4 TSG-6與炎癥反應(yīng)免疫組化染色顯示TSG-6實(shí)驗(yàn)組IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)較PBS對(duì)照組顯著。見圖4。所有提取RNA樣品A260／A280比值均在1.8～2.0，說明標(biāo)本提取RNA純度較理想，RTPCR半定量檢測證明3種炎癥因子于TSG-6實(shí)驗(yàn)組表達(dá)均明顯低于PBS對(duì)照組。見表2。結(jié)果提示TSG-6具有抑制炎癥因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)的作用。

表2 兩組瘢痕組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA相對(duì)定量值（n＝12，±s）

與PBS對(duì)照組比較：*P＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α TSG-6實(shí)驗(yàn)0.675±0.009*0.585±0.029*0.596±0.013*PBS對(duì)照0.756±0.0360.624±0.0200.618±0.012

3 討論

皮膚創(chuàng)傷愈合一般經(jīng)歷炎癥、增殖和成熟或重塑3個(gè)階段。炎癥反應(yīng)可作為抗感染的免疫屏障，同時(shí)刺激纖維蛋白合成以閉合創(chuàng)面。因此，適度的炎癥反應(yīng)有利于創(chuàng)面愈合，然而過度炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致病理性瘢痕的形成。TSG-6是已被證實(shí)的具有明顯抗炎作用的細(xì)胞因子。它可以抑制炎癥因子IL-6、IL-1β等的表達(dá)、抑制中性粒細(xì)胞浸潤、減少炎性損傷，從而保護(hù)角膜免受化學(xué)及機(jī)械損害［6］；在關(guān)節(jié)炎鼠模型中，TSG-6可使炎癥局限，明顯減輕關(guān)節(jié)水腫，軟骨和骨質(zhì)破壞得到很好地控制［7］。研究［8］證實(shí)，TSG-6主要是通過與HA、間α胰蛋白酶抑制物（IαI）、CD44等氨基葡聚糖類物質(zhì)結(jié)合發(fā)揮上述生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)瘢痕組織炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α于TSG-6實(shí)驗(yàn)組表達(dá)均低于PBS對(duì)照組，結(jié)果提示TSG-6在瘢痕形成過程中亦具有明顯抗炎作用。

病理性瘢痕常以成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積為特征，其中成纖維細(xì)胞是參與組織修復(fù)的主要功能細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，膠原等細(xì)胞外基質(zhì)主要是由成纖維細(xì)胞合成和分泌的。因此，如何誘導(dǎo)瘢痕組織成纖維細(xì)胞凋亡可能是瘢痕治療新的方式。Seidita et al［9］研究表明p53基因缺損的細(xì)胞中無TSG-6基因的表達(dá)，而在p53基因依賴的凋亡途徑中TSG-6表達(dá)水平上調(diào)，且在p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期G1期靜止中，TSG-6直接受p53下游效應(yīng)因子的調(diào)控。由此，可推測p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可能是TSG-6的另一生物學(xué)作用。同時(shí)，Choi et al［10］發(fā)現(xiàn)TSG-6可抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，而NF-κB在增生性瘢痕形成中具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。這些研究提示TSG-6可能具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Qi et al［11］實(shí)驗(yàn)顯示TSG-6的抗纖維化作用。為進(jìn)一步探討TSG-6對(duì)瘢痕組織成纖維細(xì)胞凋亡的影響，本研究以透射電鏡觀察及TUNEL法檢測瘢痕組織成纖維細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示TSG-6實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)明顯升高，但其機(jī)制尚不明確。

Tan et al［4］發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中TSG-6表達(dá)水平較無瘢痕修復(fù)皮膚明顯減少，但較正常皮膚增多，且HA、IαI的表達(dá)及分布與TSG-6相一致。TSG-6序列含有高度保守的HA結(jié)合區(qū)，HA和TSG-6結(jié)合非常穩(wěn)定［12］。已知HA可通過抑制前列腺素E2的水平、炎性細(xì)胞的趨化及氧自由基的產(chǎn)生等抗炎作用及抑制成纖維細(xì)胞分化等減少瘢痕形成，且在胎兒皮膚無瘢痕愈合過程中存在高濃度的HA［13］。課題組前期研究［14］表明TSG-6與病理性瘢痕形成具有相關(guān)性，本研究顯示TSG-6實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積明顯減低，同時(shí)證實(shí)TSG-6對(duì)瘢痕形成具有明顯抑制作用。

綜上所述，通過早期創(chuàng)面TSG-6干預(yù)并予瘢痕組織局部注射TSG-6的方法對(duì)瘢痕形成及增生具有抑制作用，其抗瘢作用可能與抑制炎癥反應(yīng)及促進(jìn)瘢痕組織細(xì)胞凋亡相關(guān)。

［1］ Lee T H，Lee G W，Ziff E B，et al.Isolation and characterization of eight tumor necrosis factor-induced gene sequences from human fibroblasts［J］.Mol Cell Biol，1990，10（5）：1982－8.

［2］ Klampfer L，Lee T H，Hsu W，et al.NF-IL6 and AP-1 cooperatively modulate the activation of the TSG-6 gene by tumor necrosis factor alpha and interleukin-1［J］.Mol Cell Biol，1994，14（10）：6561－9.

［3］ 洪學(xué)哲，李小靜，馬 莉.TSG-6與炎癥反應(yīng)［J］.安徽醫(yī)學(xué)，2012，33（2）：105－6.

［4］ Tan K T，McGrouther D A，Day A J，et al.Characterization of hyaluronan and TSG-6 in skin scarring：differential distribution in keloid scars，normal scars and unscarred skin［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol，2011，25（3）：317－27.

［5］ Morris D E，Wu L，Zhao L L，et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring：Quantitative studies［J］. Plast Reconstr Surg，1997，100（3）：674－81.

［6］ Oh J Y，Roddy G W，Choi H，et al.Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（39）：16875－80.

［7］ Milner C M，Higman V A，Day A J.TSG-6：a pluripotent inflammatory mediator？［J］.Biochem Soc Trans，2006，34（Pt3）：446－50.

［8］ Danchuk S，Ylostalo J H，Hossain F，et al.Human multipotent stromal cells attenuate lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice via secretion of tumor necrosis factor-α-induced protein 6［J］.Stem Cell Res Ther，2011，2（3）：27.

［9］ Seidita G，Polizzi D，Costanzo G，et al.Differential gene expression in p53-mediated G（1）arrest of human fibroblasts after gamma-irradiation or N-phosphoacetyl-L-aspartate treatment［J］.Carcinogenesis，2000，21（12）：2203－10.

［10］Choi H，Lee R H，Bazhanov N，et al.Anti-inflammatory protein TSG-6 secreted by activated MSCs attenuates zymosan-induced mouse peritonitis by decreasing TLR2／NF-κB signaling in resident macrophages［J］.Blood，2011，118（2）：330－8.

［11］Qi Y，Jiang D，Sindrilaru A，et al.TSG-6 released from intradermally injected mesenchymal stem cells accelerates wound healing and reduces tissue fibrosis in murine full-thickness skin wounds［J］.J Invest Dermatol，2014，134（2）：526－37.

［12］Lauer M E，Cheng G，Swaidani S，et al.Tumor necrosis factorstimulated gene-6（TSG-6）amplifies hyaluronan synthesis by airway smooth muscle cells［J］.J Biol Chem，2013，288（1）：423－31.

［13］Longaker M T，Peled Z M，Chang J，et al.Fetal wound healing：Progress report and future directions［J］.Surgery，2001，130（5）：785－7.

［14］洪學(xué)哲，李小靜，寧金龍.TSG-6在病理性瘢痕中的表達(dá)及意義［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（6）：685－7.

The experimental study of anti-inflammatory cytokine TSG-6 inhibits hypertrophic scar formation in rabbit ears model

Wang Hui，Li Xiaojing，Chen Zhao
（Dept of Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effect of tumor necrosis factor α stimulated gene-6（TSG-6）on hypertrophic scarring by using a rabbit ear model.MethodsTSG-6 and PBS were injected intradermally in the right and left ear wounds，respectively.Collagen I and III expression detected by immunohistochemistry and scar elevation index（SEI）was used to evaluate the extent of scarring.The expression of inflammatory factors interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）was detected by immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction.Transmission electron microscope（TEM）and TUNEL analyses were used to detect fibroblast apoptosis.ResultsCompared with control scars，TSG-6-treated wounds exhibited decreased inflammation significantly as evidenced by the lower levels of IL-1β，IL-6，TNF-α.The apoptosis rate was higher and the SEI and the synthesis of collagens I and III were significantly decreased in the TSG-6-treated scars（P＜0.05）.ConclusionImmediate topical injection of TSG-6 during the wound healing process can reduce the severity of hypertrophic scarring in a rabbit model.The anti-cicatrix effect of TSG-6 may result from controlling inflammation，inducing fibroblast apoptosis and promoting collagen degradation.

animal model；hypertrophic scar；rabbit；inflammation；TSG-6

R 619＋.6

1000－1492（2015）01－0045－05

2014－09－25接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81272107）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，合肥 230022

王 暉，男，碩士研究生；李小靜，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lixiaojing5＠163.com