老齡帕金森病模型小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)差異

馬曉偉，張忠霞，王彥永，李曉麗，王銘維

老齡帕金森病模型小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)差異

馬曉偉，張忠霞，王彥永，李曉麗，王銘維

目的探討老齡帕金森病（PD）模型小鼠行為學(xué)改變及黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)差異。方法

老齡；帕金森?。谎趸瘧?yīng)激；SAMP8；MPTP

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SAMP8小鼠，雌性，10月齡，共16只，26～30 g，清潔級(jí)，由香港中文大學(xué)解剖學(xué)系惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器MPTP（美國Sigma公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；RNeasy Mini Kit；RT2 First Strand Kit；RT2 SYBR Green Master Mix

（美國QIAGEN公司）；Real-time PCR Array（Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense；PAMM-065A；美國SABiosciences公司）；A7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5417R超低溫離心機(jī)（德國eppendorf公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對照組（8只）和模型組（8只）。模型組小鼠背部皮下注射MPTP，連續(xù)注射4次，每次14 mg／kg，每次間隔2 h。對照組每次均注射等體積無菌生理鹽水。于第1次注射72 h進(jìn)行行為學(xué)測試后處死。

1.3.2 行為學(xué)檢測 用藥后72 h對兩組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試，采用懸尾實(shí)驗(yàn)檢測其運(yùn)動(dòng)功能。實(shí)驗(yàn)方法同文獻(xiàn)［6］描述。實(shí)驗(yàn)在隔音、安靜的房間進(jìn)行。將小鼠倒置懸掛于實(shí)驗(yàn)箱中（長×寬×高為30 cm×25 cm×25 cm，懸掛鼠尾的吊鉤距離鼠尾15 mm，通過一連接裝置與鼠尾相連），與實(shí)驗(yàn)箱連接的電腦分析系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)小鼠的靜止時(shí)間。

本算法共實(shí)現(xiàn)高壓開關(guān)絕緣3種狀態(tài)的識(shí)別,分別為正常態(tài),電暈態(tài)和高壓放電態(tài)[11]。設(shè)G1為電暈態(tài)的語料,其中包含C11～C1J1共J1條語料,將每條語料分幀,則電暈態(tài)共有P1=J1×MJ1幀(MJ1為每條語料的幀數(shù));然后,對每幀語料訓(xùn)練得到GMM模型,可得對應(yīng)的GMM參數(shù)。同理,其他狀態(tài)的GMM參數(shù)也可以得到。這些參數(shù)在后續(xù)的識(shí)別過程中用于識(shí)別高壓開關(guān)柜正常態(tài),電暈態(tài)和高壓放電態(tài)3種狀態(tài)。

1.3.3 DA水平的檢測 各組取4只小鼠處死，冰上迅速剝離出中腦黑質(zhì)部分，加入遇冷的高氯酸進(jìn)行勻漿，低溫離心機(jī)中4℃離心30 min，10 000 r／min，取上清液，采用高效液相-電化學(xué)法（HPLCECD）檢測DA含量。電化學(xué)檢測器的工作電壓為0.7 V，進(jìn)樣量為20 μl，流速為0.6 ml／min。

1.3.4 PCR Array檢測 氧化應(yīng)激和抗氧化PCR芯片共有84個(gè)基因，包括抗氧化基因、ROS代謝基因和氧運(yùn)載基因。首先將小鼠迅速斷頭取腦，在冰上剝離出紋狀體組織，電子天平稱重后即刻使用RNeasy Mini Kit提取紋狀體組織的RNA，微量分光光度計(jì)測定RNA濃度及質(zhì)量；使用RT2 First Strand Kit將1 000 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA；使用小鼠氧化應(yīng)激及抗氧化聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物序列分析（Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense RT2 Profiler PCR Array），檢測模型組及對照組老齡SAMP8小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因的差異表達(dá)。PCR Array結(jié)果使用SABiosciences PCR Array數(shù)據(jù)分析Excel模板進(jìn)行分析，上調(diào)或下調(diào)水平2倍及以上的基因?yàn)橛幸饬x。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組相比，模型組小鼠懸掛的靜止時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝11.27，P＜0.01）。見圖1。

2.2 DA水平的改變與對照組相比，模型組小鼠在注射MPTP后72 h DA水平下降了81.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝16.86，P＜0.01）。見圖2。

2.3 氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)PCR Array結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組小鼠嗜酸粒細(xì)胞過氧化物酶（eosinophil peroxidase，EPX）、生長因子受體結(jié)合蛋白2相關(guān)結(jié)合蛋白1（growth factor receptor bound protein 2-associated protein 1，GAB1）、谷胱甘肽過氧化物酶3、6、8（glutathione peroxidase 3，6，8，GPX3，6，8）、乳酸過氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）、肌紅蛋白（myoglobin，MB）、膜蛋白棕櫚?；?（membrane protein palmitoylated 4，MPP4）、神經(jīng)珠蛋白（neuroglobin，NGB）、核氧化還原蛋白（nucleoredoxin，NXN）、過氧化物氧化還原酶1（peroxiredoxin 1，PRDX1）、溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族41成員3（solute carrier family 41 member3，SLC41A3）12種基因分別依次下調(diào)4.32、2.01、3.37、2.74、2.68、2.85、3.44、2.38、2.23、2.32、4.29及2.11倍；可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶2（inducible Nitric oxide synthase 2，iNOS2）、煙酞胺腺嘌呤二核苷酸磷酸環(huán)氧化酶（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate-oxidase，NOX）及環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）基因分別上調(diào)2.57、2.01及8.61倍。見表1。

3 討論

MPTP是廣泛用于PD研究的神經(jīng)毒素，因其高親脂性可以迅速通過血腦屏障進(jìn)入大腦，之后在單胺氧化酶B的作用下于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)變?yōu)镸PP＋，在細(xì)胞膜上多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）的作用下進(jìn)入DA能神經(jīng)元，之后聚集在突觸小泡中，抑制線粒體內(nèi)電子呼吸鏈的傳遞，損傷復(fù)合體Ⅰ的功能，導(dǎo)致中腦ATP水平下降，細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）與活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生增多，引起氧化應(yīng)激的發(fā)生［7］與DA能神經(jīng)元的損傷。

本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用MPTP的基礎(chǔ)上，選用生長周期快并具有老化特征的10月齡SAMP8小鼠用于老齡PD模型的制作，結(jié)合毒素與衰老兩種致病因素，對于PD病理機(jī)制的研究比使用傳統(tǒng)小鼠模擬PD更具優(yōu)勢。為了明確PD模型是否制作成功，本實(shí)驗(yàn)在給模型組小鼠注射MPTP之后，檢測其中腦黑質(zhì)的DA含量并進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)。懸尾實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典而又能快速評價(jià)藥物毒性或藥效的方法，研究者在MPTP干預(yù)的PD模型鼠中，通過評測其懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止的持續(xù)時(shí)間來反映小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)DA能神經(jīng)元的退行性變，認(rèn)為靜止時(shí)間的延長是PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)障礙的結(jié)果［6-8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中腦的DA含量下降81.67%，懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間增加了85.7%，證實(shí)老齡SAMP8對于MPTP的易感性，復(fù)制老齡PD模型成功。

PCR Array結(jié)果顯示，與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因在mRNA水平發(fā)生改變。與對照組相比，模型組共有12種基因的改變超過2倍，其中3種上調(diào)，9種下調(diào)。ROS與RNS是體內(nèi)主要的兩種自由基。NOX是生成ROS的主要酶體［9］，iNOS2可催化合成RNS及NO，二者在模型組小鼠分別上調(diào)了2.01倍和2.57倍；COX-2通過產(chǎn)生活性氧將體內(nèi)的DA氧化為有活性的DA-醌類，使α-突觸核蛋白聚集，之后導(dǎo)致PD的病理性標(biāo)志物路易小體的形成［10］，臨床已使用其抑制劑治療PD［11］，本結(jié)果顯示其水平顯著上調(diào)。

氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)的同時(shí)，抗氧化防御體系功能下降。GPX是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，通過促進(jìn)過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物的分解，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能［12］。本研究中GPX3、6、8分別下降了3.37倍、2.74倍和2.68倍，反映出機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力的下降。PRDX1通過硫氧還蛋白還原過氧化物或超氧化物，消除代謝產(chǎn)生的過氧化物［13］，結(jié)果顯示其表達(dá)下調(diào)了4.29倍。NXN在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可與其相結(jié)合的DvI蛋白解離，激活下游的Wnt信號(hào)通路影響細(xì)胞狀態(tài)與功能。LPO可抑制脂質(zhì)過氧化，清除羥基自由基并具有抗菌活性［14］。此外，還有肌紅蛋白、促紅細(xì)胞生成素、神經(jīng)珠蛋白等幾種基因表達(dá)均下調(diào)2倍以上。

綜上所述，本研究顯示，老齡PD模型小鼠在急性損傷后72 h，氧化應(yīng)激相關(guān)基因發(fā)生差異性改變，促氧化反應(yīng)的基因上調(diào)，抗氧化基因下調(diào)，氧化應(yīng)激系統(tǒng)與抗氧化應(yīng)激體系二者的失衡導(dǎo)致機(jī)體病理生理的改變。相關(guān)基因的明確為以后臨床尋找輔助診斷指標(biāo)與治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

［1］ Morley J E，Armbrecht H J，F(xiàn)arr S A，et al.The senescence accelerated mouse（SAMP8）as a model for oxidative stress andAlzheimer＇s disease［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822（5）：650－6.

［2］ Liu J，Wang M W，Gu P，et al.Microglial activation and age-related dopaminergic neurodegeneration in MPTP-treated SAMP8 mice［J］.Brain Res，2010，1345：213－20.

［3］ Zaitone S A，Hammad L N，F(xiàn)arag N E.Antioxidant potential of melatonin enhances the response to L-dopa in 1-methyl 4-phenyl 1，2，3，6-tetrahydropyridine-parkinsonian mice［J］.Pharmacol Rep，2013，65（5）：1213－26.

［4］ Kosloski L M，Kosmacek E A，Olson K E，et al.GM-CSF induces neuroprotective and anti-inflammatory responses in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine intoxicated mice［J］.J Neuroimmunol，2013，265（1－2）：1－10.

［5］ Rekha K R，Selvakumar G P，Santha K，et al.Geraniol attenuates α-synuclein expression and neuromuscular impairment through increase dopamine content in MPTP intoxicated mice by dose dependent manner［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，440（4）：664－70.

［6］ Kida K，Yamada M，Tokuda K，et al.Inhaled hydrogen sulfide prevents neurodegeneration and movement disorder in a mouse model of Parkinson’s disease［J］.Antioxidants Redox Signal，2011，15（2）：343－52.

［7］ Ahn E H，Kim D W，Shin M J，et al.PEP-1-ribosomal protein S3 protects dopaminergic neurons in an MPTP-induced Parkinson′s disease mouse model［J］.Free Radic Biol Med，2013，55：36－45.

［8］ Mori A，Ohashi S，Nakai M，et al.Neural mechanisms underlying motor dysfunction as detected by the tail suspension test in MPTP-treated C57BL／6 mice［J］.Neurosci Res，2005，51（3）：265－74.

［9］ Hernandes M S，Café-Mendes C C，Britto L R.NADPH oxidase and the degeneration of dopaminergic neurons in parkinsonian mice［J］.Oxid Med Cell Longev，2013，2013：157857.

［10］Rubattu S，Mennuni S，Testa M，et al.Pathogenesis of chronic cardiorenal syndrome：is there a role for oxidative stress？［J］.Int J Mol Sci，2013，14（11）：23011－32.

［11］Akula K K，Dhir A，Kulkarni S K.Rofecoxib，a selective cyclooxygenase-2（COX-2）inhibitor increases pentylenetetrazol seizure threshold in mice：possible involvement of adenosinergic mechanism［J］.Epilepsy Res，2008，78：60－70.

［12］Cojocaru I M，Cojocaru M，Sapira V，et al.Evaluation of oxidative stress in patients with acute ischemic stroke［J］.Rom J Intern Med，2013，51（2）：97－106.

［13］Kruzel M L，Actor J K，Zimecki M，et al.Novel recombinant human lactoferrin：differential activation of oxidative stress related gene expression［J］.J Biotechnol，2013，168（4）：666-75.

［14］Funato Y，Miki H.Redox regulation of Wnt signalling via nucleoredoxin［J］.Free Radic Res，2010，44（4）：379－88.

Oxidative stress related gene expression difference in aging Parkinson’s disease model mice

Ma Xiaowei，Zhang Zhongxia，Wang Yanyong，et al
（Dept of Neurology，The First Hospital of Hebei Medical University，Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory，Shijiazhuang 050031）

ObjectiveTo explore the behavior changes and oxidative stress related gene expression difference in nigro-striatal system of aging Parkinson’s disease model mice.MethodsSenescence-accelerated mouse prone 8（SAMP8）aged 10-month old in sum of 16 were randomly divided into control group and model group.Acute injury was made by subcutaneous injections of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP）to mice in model group，while a corresponding volume of saline was given to the control.72 hours after injection，all the animals were tested by the behavioral test.Dopamine（DA）contents in nigro were measured by a high performance liquid chromatography with electochemical detector，and the oxidative stress related genes expression was detected by polymerase chain reaction array（PCR Array）.ResultsCompared with the control group，the DA levels and behavioral performance were both remarkably decreased in model group（P＜0.01）.Cyclooxygenase-2，inducible Nitric oxide synthase 2，reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase were up-regulated，while 9 genes such as glutathione peroxidase 3，6，8 were all down-regulated significantly（fold change＞2）.ConclusionUp-or down-regulation of oxidative stress related genes may result in the occurence of oxidative stress in aging PD model mice.

aging；Parkinson′s disease；oxidative stress；SAMP8；MPTP

R 742.5

1000－1492（2015）01－0029－04

2014－09－24接收

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（編號(hào)：20110302、20130272）

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省腦老化與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050031

馬曉偉，女，碩士，副主任醫(yī)師；王銘維，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wmw＠hebmu.edu.cn

10月齡快速老化P8系（SAMP8）小鼠16只，隨機(jī)均分為對照組和模型組。模型組小鼠背部皮下注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）制成急性損傷模型，對照組小鼠給予同量生理鹽水。給藥后72 h進(jìn)行行為學(xué)測試，高效液相色譜法檢測黑質(zhì)多巴胺（DA）含量，PCR Array檢測其紋狀體氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，模型組小鼠DA水平下降，行為學(xué)成績下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；環(huán)氧化酶-2、可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶2、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶基因表達(dá)上調(diào)；而谷胱甘肽過氧化物酶3、6、8等9種基因明顯下調(diào)（改變倍數(shù)＞2）。結(jié)論 老齡PD模型小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)的基因發(fā)生上調(diào)或下調(diào)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。