骨髓源性EPCs對(duì)脊髓源性NSCs增殖分化的影響

張 碩，杜怡斌，杜公文，張 輝，余 濤，方家劉，高維陸，尹宗生

骨髓源性EPCs對(duì)脊髓源性NSCs增殖分化的影響

張 碩1，杜怡斌2，杜公文2，張 輝2，余 濤2，方家劉2，高維陸2，尹宗生

目的觀察骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）對(duì)脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）增殖分化的影響。方法通過密度梯度離心法獲取骨髓血單個(gè)核細(xì)胞，以EBM-2進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，成熟的方法獲取及鑒定SD大鼠的脊髓NSCs，1×105／ml第3代NSCs置于Transwell小室下層與1×105／ml上層原代EPCs進(jìn)行體外1∶1共培養(yǎng)，以單純第3代的NSCs培養(yǎng)為對(duì)照，培養(yǎng)7 d，雙盲法分別計(jì)數(shù)各組在相差顯微鏡下神經(jīng)球形成的數(shù)目，并用目鏡測微尺測量神經(jīng)球的平均直徑，通過5%血清誘導(dǎo)培養(yǎng)NSCs 7 d后，行β-微管蛋白－Ⅲ免疫熒光染色，Hoechst細(xì)胞核染色后在顯微鏡下計(jì)算神經(jīng)元／細(xì)胞總數(shù)得出百分率。結(jié)果骨髓源性EPCs與脊髓源性NSCs共培養(yǎng)組神經(jīng)球平均數(shù)目為（22.27±3.85）個(gè)，平均直徑為（61.70±7.21）μm，誘導(dǎo)培養(yǎng)后分化為神經(jīng)元的平均百分率為（46.10±3.70）%，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 骨髓源性EPCs能促進(jìn)脊髓源性NSCs增殖及其向神經(jīng)元分化。

NSCs；EPCs；增殖；分化；微環(huán)境；脊髓損傷

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）移植一直是脊髓損傷的主導(dǎo)研究手段，通過促進(jìn)移植到損傷脊髓中的NSCs有效分化為神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)生發(fā)，從而達(dá)到重建神經(jīng)通路，促進(jìn)脊髓神經(jīng)修復(fù)的作用。但大量實(shí)驗(yàn)研究［1］顯示移植到脊髓中的NSCs最終絕大部分分化成為星形膠質(zhì)細(xì)胞形成瘢痕，神經(jīng)生發(fā)的比例很低。脊髓本身存在一定數(shù)量的NSCs（內(nèi)源性NSCs），NSCs或其他類型干細(xì)胞甚至神經(jīng)組織的移植，其作用都是改善了脊髓損傷后局部的微環(huán)境，通過對(duì)脊髓NSCs的誘導(dǎo)作用，從而促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)［2］。研究［3］表明影響NSCs增殖分化的外在因素包括細(xì)胞因子和微環(huán)境，是多種細(xì)胞因子相互促進(jìn)影響的結(jié)果，脊髓損傷后出血、水腫、缺氧及炎癥造成內(nèi)環(huán)境的破壞不利于NSCs神經(jīng)生發(fā)，有效改善脊髓微環(huán)境是研究修復(fù)脊髓損傷的關(guān)鍵。NSCs所處的微環(huán)境中，血管內(nèi)皮細(xì)胞起著重要的營養(yǎng)支持作用，神經(jīng)生發(fā)往往出現(xiàn)于血管生發(fā)之后，血管生發(fā)為神經(jīng)生發(fā)提供了良好的平臺(tái)，兩者相輔相成，所共處的環(huán)境被稱為神經(jīng)血管微環(huán)境［4］。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）主要來源于骨髓內(nèi)，并以不同分化階段存在于外周血，研究［5］表明EPCs及血管內(nèi)皮細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)神經(jīng)的生發(fā)，其中主要有血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGF）等。該研究采用EPCs與NSCs共培養(yǎng)的方法，觀察EPCs對(duì)NSCs增殖及向神經(jīng)元分化的影響，為EPCs移植修復(fù)受損神經(jīng)和治療脊髓損傷提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料骨髓源性EPCs的供體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雄性，90～120 g，SPF級(jí)；脊髓源性NSCs的供體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新生SD大鼠，SPF級(jí)，5～7 d；均由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。EBM-2培養(yǎng)基（CC-3156）由EBM-2與EGM-2 SingleQuots組成，后者含血清10 ml、氫化可的松0.2 ml、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）2 ml、VEGF 0.5 ml、IGF 0.5 ml、抗壞血酸0.5 ml、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）0.5 ml、GA-1000 0.5 ml、肝素0.5 ml，購自美國Clonetics公司；大鼠骨髓淋巴細(xì)胞分離液試劑盒，購自天津TBM公司；鼠纖維聯(lián)接蛋白（rat fibronectin，F(xiàn)N）購自美國Gene Operation公司；Dil-Ac-LDL購自美國Invitrogen公司；CD133抗體購自美國Biorbyt公司；DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基、B27、左旋谷氨酸均購自美國Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自美國Peprotech公司；Flk-1抗體、FITC-UEA-1、大鼠Nestin抗體、β-Tubulin（3H3091）抗體均購自美國Santa Cruz公司；24孔板Transwell（孔徑0.3 μm）購自美國Corning公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓源性EPCs分離培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)［6－7］方法，SD大鼠（90～120 g）頸椎脫臼法處死，消毒后無菌條件下取出雙下肢股骨及脛骨，剪去兩端干骺端，暴露骨髓腔，一次性注射器抽取F液沖洗收集骨髓血，1 800 r／min離心20 min，棄上清液，沉淀用全血組織稀釋液懸起，取等體積C液5 ml加入15 ml離心管，再緩慢將細(xì)胞懸液加于C液之上，兩個(gè)體積比為1∶1，注意保持兩者之間的界面清晰，勿使其彼此混合，水平離心機(jī)離心，1 500 r／min離心25 min，離心管從上到下依次為稀釋液層，薄薄云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，透明分離液層，紅細(xì)胞層。以毛細(xì)管吸出單個(gè)核細(xì)胞層，以細(xì)胞洗滌液離心洗滌細(xì)胞2次，棄上清液，細(xì)胞沉淀以EBM-2完全培養(yǎng)基重懸，并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×105／ml細(xì)胞濃度接種到預(yù)先用FN（10 μg／ml）包被過的24孔板中，每孔1 ml，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞分散均勻，37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 d后首次換液去除為貼壁細(xì)胞，以后隔3 d換液，約9 d左右，細(xì)胞融合度達(dá)到約90%，即可傳代。

1.2.2 骨髓源性EPCs鑒定 參考文獻(xiàn)［6－7］方法，EPCs免疫熒光化學(xué)染色：取培養(yǎng)8 d的EPCs，孔內(nèi)培養(yǎng)液吸棄，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗，0.5%Triton X-100破膜10 min，PBS沖洗后10%山羊血清封閉置于CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，吸棄多余血清，滴加小鼠抗CD133（1∶100）及兔抗VEGFR-2（1∶100）一抗，室溫過夜，PBS沖洗，加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶100），避光孵育1 h，PBS沖洗，添加10 μg／ml Hoechst33342核染色5 min，PBS沖洗，抗熒光淬滅液封片，倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。Dil-Ac-LDL與FITC-UEA-1檢測：取培養(yǎng)8 d的EPCs，吸棄孔內(nèi)液體，PBS沖洗后，每孔加入400 μl Dil-Ac-LDL（10 mg／L），CO2培養(yǎng)箱避光4 h后取出，PBS沖洗后4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗；每孔加入400 μl FITC-UEA-1（10 mg／L），孵育1 h，PBS沖洗，抗熒光淬滅液封片，倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.2.3 脊髓源性NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 參考文獻(xiàn)［8］方法，5～7 d新生SD大鼠，頸椎脫臼法處死，消毒后在超凈臺(tái)內(nèi)剪開背部皮膚，無菌條件下取出胸腰段脊髓，剪碎至0.5 mm3大小，反復(fù)吹打后200目細(xì)胞篩濾去組織雜質(zhì)，收集懸液離心，1 000 r／min離心5 min，沉淀用NSCs培養(yǎng)基（含10 ng／ml bFGF、20 ng／ml EGF、2%B27和0.6 mg／ml谷氨酰胺的DMEM／F12液）重懸，接種于培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d半量換液，約7～9 d以機(jī)械吹打法傳代。取狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞球行Nestin鑒定。

1.2.4 骨髓源性EPCs對(duì)脊髓源性NSCs增殖及分化的影響 參考文獻(xiàn)［9］方法，對(duì)照組：收集純化后培養(yǎng)的第3代NSCs細(xì)胞球吸管緩慢吹打成單細(xì)胞懸液，去除原培養(yǎng)液，以1×105／ml接種于含有涂有多聚賴氨酸的無菌蓋玻片24孔培養(yǎng)板，更換培養(yǎng)液為DMEM／F12＋無血清EBM-2（1∶1），37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d半量換液，培養(yǎng)7 d，觀察NSCs生長情況。EPCs和NSCs共培養(yǎng)組：同對(duì)照組的基礎(chǔ)上在孔內(nèi)放置24孔板Transwell，取載有貼壁原代生長良好EPCs（細(xì)胞融合度達(dá)到約90%）蓋玻片，EPCs置于Transwell膜上，NSCs位于Transwell膜下。記細(xì)胞數(shù)為1×105／ml，兩者比例為1∶1，37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)7 d，100個(gè)隨機(jī)視野下雙盲法分別計(jì)數(shù)各組在相差顯微鏡下克隆球形成的數(shù)目，并隨機(jī)選取20個(gè)視野并用目鏡測微尺測量每個(gè)視野所有神經(jīng)球的平均直徑（每個(gè)神經(jīng)球的直徑＝橫徑／2＋垂直徑／2），取均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。觀察后，兩組均用5%血清誘導(dǎo)培養(yǎng)NSCs 7 d，行β-微管蛋白-Ⅲ免疫熒光染色，Hoechst核染色，隨機(jī)取20個(gè)視野，在顯微鏡下計(jì)算神經(jīng)元／細(xì)胞總數(shù)得出百分率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較使用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EPCs分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果新分離出的骨髓單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，體積較小，見圖1A；48 h待細(xì)胞貼壁緊密后首次換液，移除懸浮細(xì)胞，首次換液后細(xì)胞生長加快，可見紡錘形、三角形、圓形等不同形態(tài)的細(xì)胞，見圖1B；第7天可見EPCs的形態(tài)特征，以梭形細(xì)胞為主，見圖1C；第9～10天，細(xì)胞迅速增殖，融合度達(dá)到80%～90%，可見細(xì)胞集落及線狀結(jié)構(gòu)形成，見圖1D；第12～14天，大部分細(xì)胞呈多角形，微血管樣生長，見圖1E、F。EPCs免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果：骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)8 d時(shí)，行免疫熒光化學(xué)檢測細(xì)胞表面抗原CD133及VEGFR-2表達(dá)情況，Hoechst核染色，見圖2A；CD133染色的細(xì)胞表面呈紅色熒光，見圖2B；VEGFR-2染色的細(xì)胞呈綠色，見圖2C；大部分細(xì)胞呈雙陽性，表明該細(xì)胞為EPCs。Dil-Ac-LDL與FITCUEA-1檢測：倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，Dil-Ac-LDL細(xì)胞攝取呈紅色，見圖2D；FITC-UEA-1呈綠色，見圖2E。

2.2 NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果新鮮分離的單個(gè)NSCs呈圓形，懸浮狀，折光性較好，分散存在，2 d后細(xì)胞逐漸聚集生長形成5～7個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)7 d，增大至典型的球形（神經(jīng)球），由數(shù)百個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，懸浮生長于培養(yǎng)基中，見圖3A；原代培養(yǎng)7～9 d受周圍雜細(xì)胞及死亡細(xì)胞釋放毒性物質(zhì)的影響，細(xì)胞球中央細(xì)胞折光性逐漸減弱、周邊邊境清晰，細(xì)胞生長速度較慢，此時(shí)機(jī)械吹打分離，進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代后細(xì)胞增殖加快，形成的神經(jīng)球形狀規(guī)則，呈球形懸浮生長，收集生長狀態(tài)良好的第3代神經(jīng)球，Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，見圖3B，行抗Nestin抗體染色，見圖3C。

2.3 兩組NSCs增殖及分化結(jié)果倒置顯微鏡下觀察兩組NSCs神經(jīng)球數(shù)及球直徑的變化，NSCs接種后呈單細(xì)胞懸浮生長，2 d后，兩組NSCs逐漸聚集形成神經(jīng)球，但神經(jīng)球數(shù)量及直徑無明顯區(qū)別，4～5 d后，共培養(yǎng)組神經(jīng)球數(shù)比對(duì)照組明顯多，而且球直徑明顯增大，于培養(yǎng)7 d后100倍視野下觀察，共培養(yǎng)組神經(jīng)球數(shù)比對(duì)照組繼續(xù)增多，球直徑繼續(xù)增大，每組100個(gè)隨機(jī)視野下雙盲法分別計(jì)數(shù)各組在相差顯微鏡下神經(jīng)球形成的數(shù)目，共培養(yǎng)組為（22.27±3.85）個(gè)，對(duì)照組為（13.77±2.97）個(gè)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝17.463，P＜0.01）；并隨機(jī)選取20個(gè)視野并用目鏡測微尺測量每個(gè)視野所有神經(jīng)球的平均直徑，共培養(yǎng)組為（61.70± 7.21）μm，對(duì)照組為（41.60±4.10）μm，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.846，P＜0.01）。兩組觀察后5%血清誘導(dǎo)培養(yǎng)NSCs 7 d后，Hoechst核染色，行β-微管蛋白-Ⅲ免疫熒光染色，隨機(jī)取個(gè)20視野，在顯微鏡下計(jì)算神經(jīng)元／細(xì)胞總數(shù)得出百分率，共培養(yǎng)組為（46.10±3.70）%，對(duì)照組為（16.95± 3.66）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝25.046，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

脊髓損傷后引起一次機(jī)械性組織損傷和二次化學(xué)性變性，其中二次變性中關(guān)鍵的是血管的丟失，血流減少引起組織的缺氧、水腫及炎癥細(xì)胞的滲透，造成內(nèi)環(huán)境的嚴(yán)重破壞，微環(huán)境的破壞不利于脊髓內(nèi)源性神經(jīng)生發(fā)和軸突再生［3，10］。調(diào)節(jié)NSCs分化的分子機(jī)制尚不太清楚，目前研究［11－13］表明，除了NSCs固有性狀外，其外在的微環(huán)境包括生長因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞間接觸等在NSCs增殖分化過程中都扮演了重要角色。NSCs所處的微環(huán)境主要由5種細(xì)胞構(gòu)成：NSCs、傳遞放大細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，室管膜細(xì)胞被認(rèn)為是一種潛在的內(nèi)源性NSCs，血管內(nèi)皮細(xì)胞則起著重要的營養(yǎng)支持作用［4］。

EPCs能夠分泌多種細(xì)胞因子如BNDF、VEGF、IGF等均被證明能夠促進(jìn)神經(jīng)生發(fā)［11－13］。EPCs是一種異質(zhì)性的細(xì)胞群體，主要來源于骨髓復(fù)雜的前體細(xì)胞，并以不同的分化階段存在于外周循環(huán)中，骨髓中EPCs的含量遠(yuǎn)超過外周血，骨髓源性的EPCs能以血管發(fā)生的方式參與出生后的生理與病理性的血管形成，作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，能夠選擇性地歸巢受損或者缺血部位，參與局部的血管發(fā)生，從而形成血管，促進(jìn)內(nèi)皮的修復(fù)。

脊髓損傷后骨髓源性EPCs的移植能夠促進(jìn)局部新生血管的形成以及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集，減少炎癥細(xì)胞滲透［10］。在體外分離獲得脊髓損傷后出現(xiàn)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其具備NSCs的特點(diǎn)，并能夠分化為神經(jīng)元，脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增加［14］，能夠廣泛表達(dá)VEGF受體-3［15］，而VEGF又有明確的促神經(jīng)生發(fā)作用［12］，EPCs主要表達(dá)的細(xì)胞因子就是VEGF，這就充分利用反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的NSCs特性將解決內(nèi)源性NSCs的數(shù)量問題。

由于骨髓源性EPCs與脊髓源性NSCs兩種細(xì)胞的增殖周期及生長特性不同，本實(shí)驗(yàn)采用Transwell經(jīng)典共培養(yǎng)系統(tǒng)，兩者比例為1∶1，接種細(xì)胞濃度為1×105／ml，并設(shè)立對(duì)照組。7 d后，高倍鏡下共培養(yǎng)組神經(jīng)球數(shù)量比對(duì)照組明顯多，而且直徑更大；EPCs共培養(yǎng)NSCs分化的結(jié)果提示：共培養(yǎng)組β-tubulin-Ⅲ陽性率為46.10%，對(duì)照組β-tubulin-Ⅲ陽性率為16.95%。與對(duì)照NSCs組相比，共培養(yǎng)組EPCs明顯促進(jìn)NSCs的增殖及其向神經(jīng)元分化。這可能與EPCs作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞能夠分泌VEGF、BDNF、IGF、PEDF型膠原等多種細(xì)胞生長因子，通過Transwell小室中細(xì)胞不能通過聚碳酸脂膜作用于NSCs，這種調(diào)控相對(duì)于加細(xì)胞因子更具有安全性和持久性，為NSCs提供合適的微環(huán)境，促進(jìn)NSCs的增殖及其向神經(jīng)元分化。但兩者之間主要作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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The effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells on the proliferation and differentiation of spinal cord-derived neural stem cells

Zhang Shuo1，Du Yibin2，Du Gongwen2，et al
（1Dept of Orthopaedics，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）on the proliferation and differentiation of spinal cord-derived neural stem cells（NSCs）.MethodsBone marrow mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation methods and EPCs were cultured by EBM-2 basal medium，identified by fluorescent immunocytochemistry.Spinal cord-derived NSCs were isolated，cultured and identified by the mature methods.1×105／ml tertiary NSCs were plated on the base of culture wells，the upper transwell compartment was seeded with 1×105／ml primary EPCs，EPCs and NSCs（1∶1）were co-cultured in vitro，set the untreated tertiary NSCs as a control group.7 days after co-culture，the number and diameter of neurospheres were calculated and measured with the double blind method.After that，NSCs were maintained for 7 days in DMEM／F12＋5%serum medium，and immunochemically stained with neuronal specific marker β-tubulin-Ⅲ，ratio of positive cells to total cells was calculated.ResultsThe average number of neurospheres in co-culture group was（22.27±3.85）and the average diameter was（61.70±7.21）μm.The percentage of neurons immunostaining was（46.10±3.70）%，differences are statistical significance compared with the control group（P＜0.01）.ConclusionBone marrow-derived EPCs promote the proliferation of spinal cord-derived NSCs and induce the differentiation of spinal cord-derived neural stem cells into neurons.

neural stem cells；endothelial progenitor cells；proliferation；differentiation；niche；spinal cord injury

R 681.54

1000－1492（2015）01－0020－05

2014－09－25接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81171173）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：11040606Q25）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，合肥 2300222安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

張 碩，男，碩士研究生；尹宗生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yinzongsheng1961＠sina.com