吉安西雜母牛DGAT1基因K232A遺傳多態(tài)性及其對(duì)乳成分影響的分析

婁佑武，吳志勇，王榮民，陳國(guó)良，寧 財(cái)，雷初朝，黃永震＊

（1.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西 南昌330046；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100）

牛奶和乳制品是人類一個(gè)寶貴的營(yíng)養(yǎng)來源，乳成分可以通過奶牛的營(yíng)養(yǎng)和育種選擇進(jìn)行改善和提高。二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1（acyl CoA：diacylgyeerol acyltransferase，DGAT1）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種非常重要的酶，DGAT1是催化甘油三脂（triacylgycer0l，TAG）合成的最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，也是甘油三脂合成過程中唯一的關(guān)鍵酶，其主要機(jī)制是使二酰甘油加上脂肪酸?；纬扇８视?。DGATI在大多數(shù)的組織中具有較高的表達(dá)水平，特別是在乳腺、小腸、睪丸、脂肪組織和皮膚中的表達(dá)量最高，該基因在泌乳、脂肪吸收、脂蛋白組裝和脂肪形成中發(fā)揮著重要的功能［1，12］。

DGAT1在很多物種中是一種含有500個(gè)氨基酸的蛋白，具有較強(qiáng)的疏水性［2］，并具有二聚體和同源四聚體的結(jié)構(gòu)［3］。該酶參與腸道中脂肪吸收、血漿中甘油三脂濃度的調(diào)節(jié)、脂蛋白的組裝、脂肪細(xì)胞中脂肪的儲(chǔ)存、肌肉中能量代謝以及體脂的合成、禽蛋以及卵母細(xì)胞的形成［4，5］。

DGAT1是泌乳性狀候選基因，小鼠缺乏DGAT1會(huì)失去分泌乳的功能［6］。DGAT1基因K232A多態(tài)性對(duì)牛產(chǎn)乳性狀（牛奶產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量和脂肪酸組成）有重要影響［7］。DGAT1基因位于牛的14號(hào)染色體上，研究發(fā)現(xiàn)，與牛奶產(chǎn)量性狀相關(guān)的一個(gè)潛在數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）也定位在牛14號(hào)染色體上［8，9］。

在成熟的蛋白質(zhì)中，DGAT1基因外顯子8的232位氨基酸的改變，即賴氨酸突變?yōu)楸彼岬陌被嵝蛄校╬.Lys232Ala，或表示為K232A）能夠影響牛奶乳脂組成和脂肪含量［10］。奶牛DGAT1基因K232A突變產(chǎn)生的不同基因型之間在305d產(chǎn)奶量，乳脂量和乳蛋白量等差異顯著，該基因多態(tài)及其與產(chǎn)奶性狀密切相關(guān)，其效應(yīng)在不同國(guó)家的奶牛群體中得到了驗(yàn)證［7－11，13－16］。

江西吉安西雜牛是乳肉兼用型西門塔爾牛與吉安黃牛雜交產(chǎn)生的后代，適應(yīng)性好，具有比吉安黃牛產(chǎn)奶量、乳脂率高的特點(diǎn)，可開發(fā)高乳脂率的牛奶和生產(chǎn)黃油。關(guān)于江西吉安西雜母牛DGAT1基因K232A突變多態(tài)性及其與乳成分性狀的關(guān)系研究尚未見報(bào)道。因此，本研究采用PCR、DNA測(cè)序技術(shù)，酶切和瓊脂糖凝膠電泳等方法檢測(cè)了吉安西雜母牛98頭個(gè)體DGAT1基因的遺傳變異，分析了其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，并對(duì)98頭個(gè)體在該基因K232A突變位點(diǎn)的多態(tài)性與其4個(gè)乳成分指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與數(shù)據(jù)收集

本研究所用98份成年吉安西雜母牛（Xiza cattle，XZ）母牛的血樣，采自江西牛牛乳業(yè)有限公司西雜母牛群，測(cè)定的主要性狀包括：脂肪（Fat）、非脂（Non－fat）、蛋白質(zhì)（Protein）和乳糖（Milk sugar）的百分含量；測(cè)定時(shí)間為2012年1月～2014年12月。

1.2 引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的奶牛DGAT1基因的DNA序列（登錄號(hào)：AJ318490），圍繞K232A突變位點(diǎn)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物（Fp：5＇－CACCATCCTCTTCCTCAAGC－3＇；Rp：5＇－CCTCACCATCTCCAGGAGTC－3＇）；引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25μL，包括：10×Buffer（Mg2＋free）2.5μL、Mg＋2＋1.5μL、dNTPs 0.5 μL、FP 0.5μL、RP 0.5μL、DNA 模板（50ng／μL）2μL，加雙蒸水至25μL。

PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

1.3 DNA池的建立、測(cè)序分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

隨機(jī)從提取的所有DNA樣品中選出1／3的樣品，各取5μL，放入同一離心管中，混勻，調(diào)整終濃度為50～60ng／μL，快速建立吉安西雜母?；旌螪NA池。

以DNA池樣品為模板進(jìn)行擴(kuò)增，抽取5μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，將目的條帶清晰、明亮的產(chǎn)物，利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化試劑盒進(jìn)行回收及純化（北京天根生物公司），回收產(chǎn)物直接在ABI 3730自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)序（上海生物工程有限公司）。將測(cè)序結(jié)果提交http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST 網(wǎng)站比較，以檢測(cè)SNPs位點(diǎn)。

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：抽取10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性酶EaeI消化處理，選用2%（w／v）的瓊脂糖凝膠，電泳50～60min，采用EB染色，分析、拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用PopGene軟件進(jìn)行群體遺傳分析，對(duì)觀測(cè)到的基因型進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)基因頻率和基因型頻率、純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）。以及對(duì)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率分布進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)。

采用SPSS軟件（Version 16.0）的 GLM（General Linear Models）程序?qū)?DGAT1基因型與乳成分性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所用動(dòng)物模型為：Yijk＝μ＋Ai＋ Gj＋ Eijk，其中，Y－ijk：個(gè)體乳成分記錄；μ：總體均數(shù)；Ai：年齡效應(yīng)；Gj：基因型效應(yīng)；Eijk：隨即誤差。

2 結(jié)果

2.1 DGAT1基因突變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

經(jīng)DNA池PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)，吉安西雜母牛DGAT1擴(kuò)增區(qū)存在一個(gè)K232A的突變位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)也正是限制性內(nèi)切酶EaeI的酶切位點(diǎn)。所以，利用DGAT1基因擴(kuò)增片段中存在限制性內(nèi)切酶EaeI的特異性酶切位點(diǎn)特性，使用EaeI酶切結(jié)合凝膠電泳的RFLP法對(duì)吉安西雜母牛進(jìn)行分型，酶切后KK型片段大小為441bp，AA型片段大小為（239bp＋202bp），KA型片段大小為（401bp＋239bp＋202bp），判型結(jié)果如圖1所示。在所研究群體中，該位點(diǎn)存在多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)3種基因型AA、KA和KK。

圖1 吉安西雜母牛DGAT1基因突變區(qū)2%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 基因型和等位基因頻率及在吉安西雜母牛群體中的遺傳特性

從表1可知，在3種基因型AA、KA和KK中，AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。等位基因A和K在西雜母牛群體中的分布頻率分別為0.56和0.44；等位基因A的分布頻率高于K基因。PIC在西雜母牛群體中為0.371（0.25＜PIC＜0.5），屬于中度多態(tài)。平衡檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，吉安西雜母牛群體處于哈德－溫伯平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

對(duì)DGAT1基因突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率統(tǒng)計(jì)分析，該突變位點(diǎn)在吉安西雜母牛群體中基因型頻率和基因頻率及Ho、He、Ne和PIC結(jié)果見表1。

表1 吉安西雜母牛DGAT1基因K232A遺傳多態(tài)性指標(biāo)

2.3 吉安西雜母牛群體DGAT1基因突變位點(diǎn)與乳成分的相關(guān)分析

在表2中列出了吉安西雜母牛DGAT1基因突變位點(diǎn)不同基因型個(gè)體的乳脂率、乳非脂率、乳蛋白率和乳糖率的統(tǒng)計(jì)值，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)和多重比較，結(jié)果表明：KA雜合型個(gè)體的在乳脂率、非脂率、乳蛋白率和乳糖率指標(biāo)上都大于KK型AA型的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 吉安西雜母牛DGAT1基因K232A多態(tài)性與生乳檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

3.1 DGAT1基因突變多態(tài)性研究

本研究以牛DGAT1基因作為影響奶牛乳成分的候選基因，對(duì)吉安西雜母牛群DGAT1基因外顯子8區(qū)域K232A突變的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，A等位基因是群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因，AA基因型是優(yōu)勢(shì)基因型。野生純合子KK基因型少于突變純合子AA基因型，這種現(xiàn)象顯示在人工選擇，遷移，遺傳漂變過程中，動(dòng)物種群中K等位基因的頻率呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。

3.2 DGAT1基因突變對(duì)乳成分的影響

由于該缺失突變存在于牛DGAT1基因外顯子8區(qū)域，該突變可能對(duì)DGAT1基因自身的翻譯效率產(chǎn)生影響，我們推測(cè)該缺失突變對(duì)奶牛的脂肪合成性狀起了間接的作用。為了證實(shí)外顯子8區(qū)域K232A突變對(duì)牛泌乳性狀的影響機(jī)理，仍需要對(duì)牛DGAT1基因在轉(zhuǎn)錄翻譯水平做進(jìn)一步的研究。

在本研究中，我們對(duì)3種基因型與乳成分進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示：KA雜合型個(gè)體的脂肪、非脂、蛋白質(zhì)和乳糖的百分含量大于AA和KK型。推測(cè)等位基因K和A可能產(chǎn)生互作影響西雜母牛的乳成分。因此，奶牛遺傳育種工作者在西雜母牛選育過程中，應(yīng)當(dāng)盡可能的選擇KA基因型個(gè)體，進(jìn)行擴(kuò)群飼養(yǎng)，不斷提高KA基因型個(gè)體在群體中的頻率，最終育成西雜牛新品系。

3.3 DGAT1基因與泌乳性能的關(guān)系

泌乳性狀是受多基因座位控制的，影響泌乳性狀主基因的確定對(duì)我國(guó)地方黃牛品種向乳用方向培育有重要意義。候選基因法是尋找畜禽QTL一種非常有效的方法，它可以直接研究具有特定功能基因的多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀之間的關(guān)系。已有研究證明，DGAT1基因在動(dòng)物的脂代謝和泌乳過程中起著重要的作用，該基因的突變對(duì)奶牛的乳成分有重要影響。因此，可以被其作為候選基因與數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）作連鎖分析，用于數(shù)量性狀的輔助標(biāo)記選擇。在吉安西雜母牛群體中，已反映出KA基因型個(gè)體比AA、KK基因型個(gè)體在乳成分性狀上有一定的優(yōu)勢(shì)，但還必須擴(kuò)大樣品做進(jìn)一步驗(yàn)證。

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