赤道幾內(nèi)亞比奧科島居民的鐮型紅細(xì)胞病的流行病學(xué)調(diào)查

謝東德陳江濤Urbano Monsuy EyiRocio Apicante MatesaMaximo M iko Ondo ObonoCarlos Sala Ehapo岳亮郭翼華古杰超詹小芬楊輝楊惠鈿楊立業(yè)林敏★

·論著·

赤道幾內(nèi)亞比奧科島居民的鐮型紅細(xì)胞病的流行病學(xué)調(diào)查

謝東德1，2陳江濤1，3Urbano Monsuy Eyi4Rocio Apicante Matesa4Maximo M iko Ondo Obono5Carlos Sala Ehapo5岳亮6郭翼華2古杰超2詹小芬6楊輝6楊惠鈿6楊立業(yè)6林敏6★

目的了解非洲赤道幾內(nèi)亞比奧科島（Bioko Island）人群的鐮刀形紅細(xì)胞?。╯ickle cell disease，SCD）的流行病學(xué)特點。方法在2013年1月至12月期間，采用紅細(xì)胞鐮變試驗對1 036名本島居民進(jìn)行篩查。用高分辨熔解曲線（high-resolution melting，HRM）分析和PCR-DNA測序法對篩查陽性的標(biāo)本進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果赤道幾內(nèi)亞比奧科島居民的SCD發(fā)生率為16.99％（176／1 036）。HRM法與PCR-DNA測序法具有較好的一致性（100％）。結(jié)論比奧科島是SCD高發(fā)區(qū)，當(dāng)?shù)卣托l(wèi)生部門應(yīng)采取有效的干預(yù)措施來減少這種疾病的危害。HRM法對SCD的鑒定準(zhǔn)確性較高。

鐮刀形紅細(xì)胞??；比奧科島；高分辨熔解曲線分析；PCR-DNA測序

鐮刀形紅細(xì)胞病（sickle Cell Disease，SCD）是世界范圍最為常見和臨床上最重要的一種常染色體隱性遺傳血紅蛋白病，它是由β珠蛋白基因的6號密碼子GAG＞GTG突變而成的血紅蛋白S（hemoglobin S，HbS）導(dǎo)致的［1］。該病的純合子表型能夠?qū)е绿核喇a(chǎn)或成年前死亡，而雜合子表型能導(dǎo)致貧血、感染合并癥、慢性器官損害等一系列并發(fā)癥［2－3］。全世界每年大約有30萬的新生兒受到鐮刀形紅細(xì)胞病的影響，其中75％的病例發(fā)生在撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)［1，4］。對于鐮刀紅細(xì)胞貧血，目前只能依靠長期輸血治療，此外就是應(yīng)用基因診斷技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，降低人群的發(fā)病率［5］。

比奧科島（Bioko Island），是一個位于非洲幾內(nèi)亞灣中的島嶼。該島距尼日利亞南部海岸約100公里，在非洲西部大陸赤道幾內(nèi)亞西北160公里處，是赤道幾內(nèi)亞共和國的首都馬拉博（Malabo）的所在地。全島有居民26萬人，瘧疾感染率高達(dá)29.8％。該國的醫(yī)療衛(wèi)生水平低，人民生活條件差，是瘧疾和鐮刀形紅細(xì)胞病的高度流行區(qū)和高發(fā)地區(qū)，由于當(dāng)?shù)芈浜蟮慕?jīng)濟(jì)和技術(shù)，目前沒有任何鐮刀形紅細(xì)胞病的流行病學(xué)的數(shù)據(jù)。

自1971年開始，廣東省承派援助赤道幾內(nèi)醫(yī)療隊幫助當(dāng)?shù)鼐用裰委煰懠布捌渌A(chǔ)疾病。因此，我們在馬拉博地區(qū)醫(yī)院的支持下，對比奧科島進(jìn)行了一次聯(lián)合的流行病學(xué)調(diào)查，總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2013年1月至2013年12月，1 036名比奧科島的當(dāng)?shù)鼐用瘢挲g：1～84歲，95％的個體為超過18歲的成人），參與了我們的調(diào)查，含男性535名，女性501名。在取得馬拉博地區(qū)醫(yī)院倫理委員會和患者或其監(jiān)護(hù)人的同意后，在馬拉博地區(qū)醫(yī)院檢驗科用EDTA-K2真空管抽取外周血2 m L，同時用903標(biāo)本采集濾紙（Whatman-新華公司）制備干血斑，干燥后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器及耗材

LightCycle 480II熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司），MJm im i型梯度PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad），微量加樣器（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（中國蘇州精華設(shè)備有限公司），干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），TGL-20B型和TGL-28C-C型臺式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），LightCycle 480II熒光定量PCR儀專用96孔PCR板及封板膜（荷蘭Bioplastics公司）。

1.3 紅細(xì)胞鐮變（HbS）試驗

按照《全國檢驗操作規(guī)程》［6］第三版進(jìn)行操作，步驟如下：（1）在清潔載玻片上被檢鮮血1滴，然后加20 g／L的偏重亞硫酸鈉液1滴混勻；（2）加蓋玻片，避免氣泡，用凡士林液體石蠟合劑封固，置于37℃溫箱；（3）在溫育15 m in、30 m in、1 h、2 h及12 h后分別用高倍顯微鏡觀察有無鐮狀紅細(xì)胞形成，同時用正常人做對照檢查。

1.4 DNA提取

按照本實驗室以往文獻(xiàn)［7］，用Chelex-100法提取所有紅細(xì)胞鐮變試驗篩查陽性者的干血斑樣本DNA，步驟如下：首先剪取0.5 cm×0.5 cm血斑，加入500μL蒸餾水，震蕩30 s，然后靜置半小時以上，然后用13 600 rpm離心4 m in，棄上清；加入160μL的10％濃度的Chelex-100，振蕩后用56℃孵育2 h，接著98℃變性8 m in，振蕩30 s，13 500 rpm離心1 m in，最后置于冰箱4℃冷卻30 m in以上，吸取上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 高分辨熔解曲線（high-resolution Melting，HRM）分析

根據(jù)本實驗室以往建立的HRM鑒定HbS的方法［8］，針對導(dǎo)致血紅蛋白S的HBB：c.20 A＞T位點，采用如下引物：HRM-S-F：5′-CACCATGG TGCATCTGACTCC-3′；HRM-S-R：5′-CACCAA CT TCATCCACG TTCA-3′。反應(yīng)體系總體積20 μL，包括0.2μL的HotStat DNA聚合酶（大連寶生物工程公司），4μL的5×PCR buffer（Mg2＋plus），1.6μL的脫氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol／μL），上述引物各1μL（5μmol／μL），9.2 μL的雙蒸滅菌水，1μL的LC GreenⅠ染料（北京思博全）和2μL模板DNA。PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析均在LightCycle 480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增參數(shù)如下：預(yù)變性95℃3 m in；擴(kuò)增98℃10 s，68℃15 s共45個循環(huán)。熔解曲線鑒定程序如下：95℃1 m in，40℃1 m in，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從60℃至95℃，溫度上升為1℃／s，且每升高1℃進(jìn)行25次的數(shù)據(jù)采集，最終采用LightCycle 480Ⅱ軟件對進(jìn)行分析。

1.6 PCR-DNA測序

對于HRM鑒定為HbS突變的樣本，用PCRDNA測序進(jìn)一步確認(rèn)。采用本實驗以往建立的β珠蛋白基因測序引物［9］，擴(kuò)增體系為為25μL，包括2μL模板DNA，12.5μL PCR混合M ix（北京艾德來），上下游引物各1μL，純凈水8.5μL。擴(kuò)增后用以2％的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，然后純化后用ABI3730雙向測序，查找突變點。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM＠SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。按Hardy-Weinberg平衡公式，當(dāng)P＜0.05時，說明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾遺傳群體。

2 結(jié)果

在1 036名參加篩查的比奧科島居民中，高達(dá)16.99％（176／1 036）的樣本的紅細(xì)胞鐮變試驗篩查陽性，如圖1所示，絕大多數(shù)陽性的血樣在60 m in以后鐮變現(xiàn)象就變得明顯，只有1例1周歲以下的嬰兒的60 m in的鐮變現(xiàn)象不太明顯，但24 h時依然可以觀察到一定比例的鐮刀形紅細(xì)胞。我們認(rèn)為，這應(yīng)該是該嬰兒的血液里面還有較多含量的HbF，因此降低了HbS的比例，使紅細(xì)胞鐮變的現(xiàn)象減弱。

圖1 紅細(xì)胞鐮變（HbS）試驗檢測結(jié)果Figure 1 The results of sickle solubility test

所有的篩查陽性結(jié)果，均用高分辨熔解曲線（圖2）和PCR-DNA測序分析（圖3）。我們發(fā)現(xiàn)鐮刀形紅細(xì)胞病雜合子表型（c.20 A＞T雜合子）的曲線很容易和正常人（野生型）曲線區(qū)分。176例樣本通過HRM和PCR-DNA測序法均鑒定為鐮刀型紅細(xì)胞病雜合子，基因頻率為16.99％（176／1 036），2種方法的符合率100％。由于我們的樣本絕大多數(shù)采集自島上的成人，而且鐮刀形紅細(xì)胞病患者的純合子在胎兒時就死產(chǎn)或成年前死亡，因此數(shù)據(jù)不能符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝8.927，P＝0.002）。

圖2 高分辨熔解曲線分析結(jié)果Figure 2 The results of HRM assay and PCR-DNA sequencing

圖3 PCR-DNA測序結(jié)果Figure 3 The results of PCR-DNA sequencing

3 討論

鐮刀形紅細(xì)胞病是世界上危害最為嚴(yán)重的一種單基因遺傳病，純合子表型能夠?qū)е绿旱乃喇a(chǎn)或需要長期輸血才能存活；雜合子表型導(dǎo)致患者體內(nèi)的紅細(xì)胞容易破壞且堵塞血管，會造成局部缺血、貧血、感染合并癥、慢性器官損害等一系列并發(fā)癥使患者的壽命縮短到40歲左右［2－3］。與非洲中部報道的10％至40％的發(fā)生率一致［10－12］，比奧科島居民鐮刀形紅細(xì)胞病發(fā)生率也高達(dá)16.99％?；谶@個調(diào)查數(shù)據(jù)，按照Hardy-Weinberg平衡公式進(jìn)行估算，即在本島26萬居民之中大約有4萬人的雜合子著存在，同時也造成每250個婦女懷孕就會產(chǎn)生1個純合子，給當(dāng)?shù)鼐用竦慕】岛蜕鐣?jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重的影響。赤道幾內(nèi)亞是一個發(fā)展中國家，缺乏足夠的人力和物力進(jìn)行流行病學(xué)的調(diào)查，本研究提供了比奧科島鐮刀形紅細(xì)胞病的流行病學(xué)資料，為比奧科島當(dāng)?shù)氐男l(wèi)生部門制定鐮刀形紅細(xì)胞病防控政策提供了參考。

傳統(tǒng)的鐮刀紅細(xì)胞病診斷方法，包括紅細(xì)胞鐮變試驗、血紅蛋白電泳、AMRS-PCR和PCR限制性片段多態(tài)性（PCR-RFLP），存在著耗時長、操

作繁瑣、PCR產(chǎn)物污染等各種缺陷，不利于大規(guī)模的人群篩查。HRM分析是新近發(fā)展起來的高效基因檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高通量和成本低廉等優(yōu)點，非常適合單個堿基或幾個堿基的變化檢測［13］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)雜合子DNA能夠準(zhǔn)確的與野生型DNA區(qū)分開來。Chelex-100法提取血斑DNA操作簡單，價格便宜，再結(jié)合HRM法的優(yōu)點，合適在非洲地區(qū)推廣針對鐮刀紅細(xì)胞病進(jìn)行大規(guī)模的人群調(diào)查和遺傳學(xué)研究。

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Epidem iological investigation of the sickle cell disease in local inhabits on Bioko Island,Equatorial Guinea

XIE Dongde1,2,CHEN Jiangtao1,3,Urbano Monsuy Eyi4,Rocio Apicante Matesa4,Maximo M iko Ondo Obono5,Carlos Sala Ehapo5,YUE Liang6,GUO Yihua2,GU Jiechao2,ZHAN Xiaofen6,YANG Hui6,YANG Huitian6,YANG Liye6,LIN M in6★
(1.The Chinese Medical Aid Team to the Republic of Equatorial Guinea,Guangzhou,Guangdong,China, 510000；2.Department of Medical Laboratory Science,Jiangmen People's Hospital,Jiangmen,Guangdong, China,529020；3.Laboratory Medical Center,The Huizhou Central Hospital,Huizhou,Guangdong,China, 516001；4.Central Blood Transfusion Service,Hospital Regional De Malabo,Malabo,The Republic of Equatorial Guinea；5.Department of Medical Laboratory Science,Hospital Regional De Malabo,Malabo, The Republic of Equatorial Guinea；6.Laboratory Medical Center,Chaozhou Central Hospital,Southern Medical University,Chaozhou，Guangdong,China，521021)

Objective To investigate the epidem iological characteristics of the s ickle c ell d isease（SCD）in local inhabits on Bioko Island,Equatorial Guinea.Methods During January 2013 to December 2013,1 036 local inhabits were screened for SCD by sickle solubility test.Then,all the screening positive

Sickle Cell Disease；Bioko Island；H igh-resolution melting assay；PCR-DNA sequencing

中國博士后科學(xué)基金（2013M 542195）；國家自然科學(xué)基金（81101329）

1.中國第二十六批援赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療隊，廣東，廣州510000 2.江門市人民醫(yī)院檢驗科，廣東，江門529020 3.惠州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，廣東，惠州516001 4.赤道幾內(nèi)亞共和國馬拉博市馬拉博地區(qū)醫(yī)院中心血站，赤道幾內(nèi)亞5.赤道幾內(nèi)亞共和國馬拉博市馬拉博地區(qū)醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，赤道幾內(nèi)亞6.潮州市中心醫(yī)院中心實驗室，廣東，潮州521021

★通訊作者：林敏，E-mail：konfutea＠hotmail.com

samples were identified by high-resolution melting(HRM)assay and PCR-DNA sequencing.Results The prevalence of SCD in local inhabits on Bioko Island was 16.99％(176/1 036).SCD could all be efficiently identified by HRM analysis，and 100％concordance was found between the HRM analysis and the r PCRDNA sequencing.Conclusion High prevalent SCD on Bioko Island indicated that the local health department and government should make efficiently strategy for the control of SCD in the region.HRM assay is a rapid,low-cost,accurate and high-throughput method to screen for SCD which is worthy to promote its use in high-prone areas of SCD in A frica.