間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療終末期肝病前后血清甲胎球蛋白的變化

陳建華徐玉琴楊晉輝張軍

·論著·

間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療終末期肝病前后血清甲胎球蛋白的變化

陳建華1★徐玉琴2楊晉輝3張軍4

目的探討間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植治療終末期肝病甲胎球蛋白（α-fetoprotein，AFP）的變化，觀察病人肝功能有無改善。方法MSC移植治療73例終末期肝病患者，其中包括失代償期肝硬化患者45例，慢性重癥肝炎5例，監(jiān)測療前和療后1周、療后1個月、2個月AFP及肝功能變化。結(jié)果療后1周AFP較療前明顯升高，其后降低，2個月至療前水平，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。白蛋白（serum albumin，ALB）療后1月、2月與療前相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。膽堿酯酶療后2月較療前明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。所有接受干細(xì)胞移植的患者觀察過程中未出現(xiàn)肝臟及其他器官腫瘤。結(jié)論MSC移植治療終末期肝病患者安全有效。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）；移植；甲胎球蛋白（AFP）

終末期肝病目前最有效的治療方法是肝移植，但由于供體來源有限且治療費(fèi)用高昂及移植后的排斥反應(yīng)限制了其臨床大規(guī)模應(yīng)用。干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究是目前國際生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿科技，被譽(yù)為醫(yī)學(xué)史上的第二次革命。近幾年的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）不僅具有支持造血的功能，而且沒有免疫原性，能夠誘導(dǎo)免疫耐受，對同種異體免疫反應(yīng)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，目前已應(yīng)用于治療移植物抗宿主病、克羅恩氏病、肝臟纖維化和骨關(guān)節(jié)損傷等多種疾?。?］。本文采用MSC移植治療終末期肝病，療后1周甲胎球蛋白（α-fetoprotein，AFP）明顯升高。為了解其轉(zhuǎn)歸及對患者的影響，筆者收集MSC治療終末期肝病相關(guān)資料，觀察治療前后AFP和肝功能變化，探討MSC治療的臨床效果及治療過程中AFP的發(fā)展變化。

1 數(shù)據(jù)和方法

1.1 病例來源

于2009年1月至2012年10月收集昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝病科MSC治療肝硬化患者23例、哈爾濱211醫(yī)院肝病科MSC治療肝硬化患者45例，慢性重癥肝炎5例，通過病史及臨床癥狀、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查確診病例。患者年齡22～73歲（46.74±11.01）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有病例診斷均符合《肝臟病和感染病診療指南2010》。（2）年齡18～75歲的男性或女性。（3）半年內(nèi)沒有使用過MSC治療。（4）理解并簽署知情同意書者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性腫瘤患者或血液系統(tǒng)疾病。（2）過敏體質(zhì)、曾有對血制品過敏史。（3）孕婦、哺乳期婦女。（4）合并腹腔、肺部或其它系統(tǒng)感染。（5）心、肺、腎等重要臟器功能不全或衰竭以及不能配合治療者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

收集患者一般臨床數(shù)據(jù)，術(shù)前實(shí)驗(yàn)室檢查包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、血漿ALB、凝血酶原時間、國際標(biāo)準(zhǔn)化率、血氨、AFP?；颊呷朐汉缶袃?nèi)科治療，包括護(hù)肝、對癥治療等。臍帶來源的MSC由深圳市北科細(xì)胞工程研究所實(shí)驗(yàn)室制備提供。治療前1周、療后1周、療后1個月、療后2個月檢測血液中腫瘤標(biāo)記物AFP含量（化學(xué)發(fā)光法），并對患者的臨床癥狀、療效進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，變量用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示；治療前后結(jié)果比較，因是單因素且在4個時間點(diǎn)進(jìn)行采樣，故采用單因素重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MSC移植治療終末期肝病AFP變化

治療前后采用重復(fù)測量方差分析，Mauchly球形度檢驗(yàn)卡方＝21.007，P＜0.01，故用Greenhouse-Geisser進(jìn)行校正，F(xiàn)＝9.153，P＝0.029，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從表1可以看出，療后1周AFP明顯升高。

表1 MSC移植治療終末期肝病AFP變化Table 1 The changes of AFP during MSC transplantation in the treatmentof end-stage liver disease

表2 MSC移植治療終末期肝病ALB變化Table 2 The changes of ALB during MSC transplantation in the treatment of end-stage liver disease

2.2 MSC移植治療終末期肝病ALB變化

經(jīng)重復(fù)測量方差分析，Mauchly球形度檢驗(yàn)卡方＝0.426，P＞0.05，故用球形檢驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)＝2.502，P＝0.035，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Bonferroni多重比較，ALB療后1月、2月與療前相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；療后1周與療前相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。結(jié)果見表2。

2.3 MSC移植治療終末期肝病膽堿酯酶變化

經(jīng)重復(fù)測量方差分析，Mauchly的球形度檢驗(yàn)卡方＝13.703，P＝0.019，故用Greenhouse-Geisser進(jìn)行校正，F(xiàn)＝1.322，P＝0.039，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Bonferroni兩兩比較，膽堿酯酶療后2月與療前相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；療后1周、1月與療前相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。結(jié)果見表3。

表3 干細(xì)胞治療終末期肝病膽堿酯酶與療前比較Table 3 The comparison to pretherapy of cholinesterase during MSC transplantation in the treatment of end-stage liver disease

3 討論

AFP的合成部位主要在嚙齒動物及人類胚胎的肝臟，也可在卵黃囊及胃腸道等部位合成，它是嚙齒類動物和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。人類胚胎在子宮內(nèi)發(fā)育的第6周左右用雙向擴(kuò)散法即能測出AFP，到第13周左右可達(dá)到高峰，第16周后AFP的濃度迅速下降而ALB濃度上升；出生后第1周末用雙向擴(kuò)散法即不再能測出AFP［2］。AFP在原發(fā)性肝癌或胚胎性癌時增加［3－4］，所以檢查AFP在血液中的含量，對這類疾病的發(fā)現(xiàn)和診斷有重要意義。動物和人在切除部分肝臟后，組織和血清中AFP的濃度會明顯增高。肝組織發(fā)生炎癥或癌變時，AFP也會升高［5－6］。根據(jù)2011年衛(wèi)生部肝細(xì)胞肝癌規(guī)范化診治指南，血清AFP大于400 ng／m L 1個月；或AFP大于200 ng／m L持續(xù)2個月，排除妊娠和生殖腺胚胎瘤者，高度警惕肝癌，應(yīng)通過影像學(xué)檢查［7］。

本研究采用臍帶來源的MSC治療終末期肝病過程中也發(fā)現(xiàn)病人的AFP升高，從表1可知，MSC移植治療1周后，血液中的AFP明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。血清膽堿酯酶是肝病很好的標(biāo)記物，有較好的敏感性和特異性，可做為進(jìn)展期肝病判斷預(yù)后一個有價(jià)值的標(biāo)記物，其值越低，愈后越差［8］。干細(xì)胞移植后，表3結(jié)果表明膽堿酯酶與療前相比，2個月后明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因膽堿酯酶活性是反映肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)，對估計(jì)肝硬化患者肝臟儲備功能，了解病情變化及預(yù)后判定具有一定臨床價(jià)值，再結(jié)合病人的ALB較療前也有一定升高，腹水減少，乏力納差等癥狀明顯改善，表明患者預(yù)后向好的方向發(fā)展，肝功能得到一定改善。

MSC是一種多潛能干細(xì)胞，能自我更新并向不同組織分化，已在不同的動物模型上證實(shí)其可向肝原性細(xì)胞分化［9］。將人蛻膜來源的MSC與鼠肝勻漿共培養(yǎng)，分析其向肝細(xì)胞樣形態(tài)改變、表型和三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)肝特異性標(biāo)記：ALB、肝細(xì)胞生長因子受體（hepatocyte grow th factor receptor，HGFR）、AFP和細(xì)胞角蛋白-18（cytokeratin-18，CK-18），形成的肝樣細(xì)胞具有肝細(xì)胞的功能：包括糖原的存儲和吸收／分泌吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）。同時，在共培養(yǎng)過程中，AFP合成減少和ALB合成增加也與正常肝臟器官在胚胎期間發(fā)育過程中觀察到的一致［10］。當(dāng)MSC與受傷的肝組織共培養(yǎng)時，甲胎蛋白和白蛋白表達(dá)明顯升高［11－12］，這和我們觀察到的結(jié)果一致。

而MSC移植治療終末期肝病的不良反應(yīng)，有少數(shù)患者會出現(xiàn)低熱，體溫一般不超過38度，不須特殊處理或僅需對癥處理即可，1～3天內(nèi)癥狀消失；個別患者出現(xiàn)高熱寒戰(zhàn)，結(jié)合具體臨床情況進(jìn)行處理；偶有惡心和嘔吐、腹痛、皮疹發(fā)生，經(jīng)對癥處理，均在1～3天內(nèi)消失［13－14］。

血清AFP測定對急性重型肝炎臨床治療療效及預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。重型肝炎患者血清AFP含量高，則其治療后肝功能逆轉(zhuǎn)率高；反之，則肝功能逆轉(zhuǎn)率低，預(yù)后差［15－16］。Kakisaka等發(fā)現(xiàn)除了嚴(yán)重?fù)p害的肝臟，AFP在急性肝損傷或急性肝衰竭的病人中明顯升高且和細(xì)胞角蛋白-7陽性的肝臟前體細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，血清AFP水平可能反映此類病人肝臟前體細(xì)胞的誘導(dǎo)，肝前體細(xì)胞持續(xù)誘導(dǎo)直到足夠成熟肝細(xì)胞再生可能是急性肝衰竭病人恢復(fù)的必要條件。血清AFP可能是急性肝損傷或急性肝衰竭病人肝前體細(xì)胞的標(biāo)記物，若AFP水平低，則這類病人的預(yù)后較差［17］，這與我們的報(bào)道一致。

盡管MSC移植治療肝病已取得可喜的成果，但是這些研究尚處于起步階段，也缺乏合理設(shè)計(jì)的多中心隨機(jī)對照臨床研究驗(yàn)證療效及長期隨訪數(shù)據(jù)了解移植可能發(fā)生的不良反應(yīng)或并發(fā)癥。本文的不足之處是收集的數(shù)據(jù)缺乏長期隨訪數(shù)據(jù)，AFP升高的機(jī)制需要做進(jìn)一步研究。盡管如此，仍有理由相信通過深入研究，可以安全地把MSC的基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，為疑難雜癥的治療帶來更為廣闊的前景。

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The change of serumα-fetoprotein during mesenchymal stem cell transplantation in the treatment of end-stage liver disease

CHEN Jianhua1★,XU Yuqin2,YANG Jinhui3,ZHANG Jun4
(1.Department of Pharmacology,School of Pharmacy,North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan, China,637000；2.The Infectious Department,No.211 Hospital of the Chinese People's Liberation Army, Harbin,Heilongjjiang,China,150030；3.Digestive Internal Medicine,Second A ffiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunm ing,Yunnan,China,650000；4.The Life Health Department of Shen z hen Beike Biotechnology Company,Shenzhen,Guangdong,China,518057)

Objective To explore the changes ofα-fetoprotein(AFP)in end-stage liver disease after mesenchymal stem cell(MSC)transplantation and observe whether patient’s liver function had been improved.

Mesenchymal stem cell(MSC)；Transplantation；α-fetoprotein(AFP)

間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化（2011GH021787）

1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，四川，南充637000 2.哈爾濱211醫(yī)院感染科，黑龍江，哈爾濱市150030 3.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，云南，昆明650000 4.深圳市北科生物科技有限公司生命健康部，廣東，深圳518057

★通訊作者：陳建華，E-mail：623551832＠qq.com

Methods 73 patientsw ith end stage liver disease were transplanted w ith MSC,including 45 decompensated hepatic cirrhosis and 5 chronic severe hepatitis patients.The serum levels of AFP,liver function were examined 1 week before treatment and 1 week,1 month,and 2 months after treatment.Results The level of AFP increased at 1 week after treatment,and returned to normal level 2months later.T here was statistical difference between before treatmentand after treatment(P＜0.05).The results revealed a statistically significant difference between before treatment and after 1,2 months treatment in serum album in(ALB)(P＜0.05).Likew ise,there wa s significant difference between before treatment and after 2 months treatment in Cholinesterase(P＜0.05).No person suffered from any other tumor under thorough observation.Conclusion MSC transplantation is a safe and effective in the treatmentof end-stage liver disease.