幽門螺桿菌抗生素耐藥性基因檢測：下一步？

李云振葛安國王慶波高宏志王明席★胡偉鵬★

·綜述·

幽門螺桿菌抗生素耐藥性基因檢測：下一步？

李云振1，2葛安國3★王慶波1高宏志4王明席1★胡偉鵬4★

抗生素耐藥性是目前幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）根除治療失敗的重要原因。對于提高臨床治療效果，在某一地區(qū)的人群中H.pylori耐藥發(fā)生率也應(yīng)考慮。高效、快速、準確地檢測出H.pylori抗生素耐藥性和及時監(jiān)控群體耐藥發(fā)生率對提高臨床治療效果具有重要意義。目前，H.pylori抗生素的耐藥機制逐漸清楚，這有助于探索新的檢測方法、尤其是核酸檢測技術(shù)。該文總結(jié)了用于H.pylori根除治療最常用抗生素的主要耐藥機制，并著重回顧了H.pylori抗生素耐藥的基因檢測技術(shù)進展，以期對改進H.pylori抗生素耐藥的分子診斷提供理論指導(dǎo)和實踐借鑒。

幽門螺桿菌；抗生素耐藥；基因檢測

人類致病菌幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）的發(fā)現(xiàn)和研究已經(jīng)使人類對于上消化道疾病有了重新認識，并徹底改變了對該類病人的管理方式［1］。據(jù)報道，世界范圍內(nèi)有近一半人口被H.pylori感染［1］。目前，H.pylori已被認為是急性和慢性胃炎的致病菌，同時也是消化性潰瘍、胃癌和胃淋巴瘤的主要誘因［2］。治療該類疾病的常規(guī)方法是運用抗生素根除H.pylori［1］。

目前，臨床上用于根除H.pylori的常用抗生素種類和數(shù)目并不多，但耐藥性問題越來越嚴重，耐藥性產(chǎn)生是H.pylori感染治療失敗的重要原因。本文在簡單總結(jié)H.pylori常用抗生素主要耐藥機制的基礎(chǔ)上，著重回顧了H.pylori抗生素耐藥性基因檢測技術(shù)進展，以期對本領(lǐng)域的發(fā)展提供理論指導(dǎo)和實踐借鑒。

1 一線治療藥物耐藥基因檢測

1.1 克拉霉素

克拉霉素是當前治療H.pylori效力最強的抗生素，其耐藥性涉及23S rRNA基因V功能域內(nèi)發(fā)生的點突變。這些點突變能夠抑制克拉霉素與核糖體亞基的結(jié)合，從而引起H.pylori產(chǎn)生耐藥性［3］。

目前，克拉霉素耐藥性基因檢測手段主要包括限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、實時定量PCR（real time polymerase chain reaction，RTPCR）等。PCR-RFLP是最早使用且較為簡便的方法，從胃活檢標本中直接提取DNA后，使用PCRRFLP可在一天內(nèi)完成H.pylori感染和耐藥性的檢測［4］。其能檢測的與克拉霉素耐藥性相關(guān)的點突變包括A2142G、A2143G、A2142C、T2717C［5－7］，其中發(fā)現(xiàn)A2142G和A2143G最常見且最重要。然而研究表明其它克拉霉素耐藥性相關(guān)突變在某些地區(qū)也較常見，如T2717C在意大利為常見突變［6］。同時采用巢式PCR-RFLP（nested PCR-RFLP）可提高該方法的敏感性和特異性。該方法也可無需細菌培養(yǎng)而直接檢測胃液樣本和糞便樣本的H.pylori，是一種快速篩查H.pylori克拉霉素耐藥性的非入侵性方法［6］，且與酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法（ELISA）相比，具有很高的敏感性和特異性，分別為100％和90％［8］。最近該方法已經(jīng)被某些國家采用，如伊朗等，開展全國性H.pylori對克拉霉素耐藥性發(fā)生率的群體檢測研究［9］。

熒光原位雜交技術(shù)是唯一可以直接對活檢標本中微生物進行特異性可視化的檢測方法［10］。該方法檢測對象一般為A2142G、A2143G、A2144G。與PCR相比，其檢測樣本常為福爾馬林固定組織或石蠟包埋切片，無需提取細菌DNA，對完整樣本可進行半定量檢測，不到3小時即可完成檢測，與傳統(tǒng)檢測方法如與Etest［11］結(jié)果的一致性可達92.4％［12］。目前已經(jīng)開發(fā)出商業(yè)性的試劑盒，其檢測克拉霉素耐藥性的敏感性和特異性分別可達90％和100％［13］。最近，肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）-熒光原位雜交技術(shù)（PNA-FISH）使該方法也得到了改進，以H.pylori懸浮液為標本，PNA-FISH可獲得100％的敏感性和特異性［14］。隨后的研究以石蠟包埋胃活檢標本為實驗樣本，檢測結(jié)果與PCR測序結(jié)果完全一致，敏感性和特異性分別為91％和84.2％［10］。

如果不計成本的話，實時定量PCR是目前用于檢測克拉霉素耐藥性最為理想的方法。該方法檢測點突變的范圍較廣，提取DNA后的檢測時間僅需1小時［15］，且該方法可同時處理多個樣本。目前市場上已存在基于實時定量PCR技術(shù)檢測H.pylori克拉霉素耐藥性的試劑盒，且敏感性和特異性分別可達91％和96％［15］，更重要的是，該方法還可以對耐藥菌進行準確的定量，最低可準確定量300個細菌［16］。檢測樣本可包括胃活檢樣本、糞便標本、福爾馬林固定標本和石蠟包埋胃活檢標本等，無需細菌培養(yǎng)［17－18］。

此外，近年來也出現(xiàn)了新的檢測技術(shù)和診斷試劑盒，其中主要包括DPO（dual prim ing oligonucleotide）、M icroarray、GenoTypeHelicoDR［19－21］。DPO是一種新的引物技術(shù)。由于DPO通常很長，一般可達35 bp，同時含有兩個引發(fā)區(qū)域，所以該引物具有很高的特異性，可用于檢測單核苷酸的多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。最近的研究表明，與實時定量PCR相比，其靈敏度可達97.7％，同時具有更高的特異性（83.1％vs 80.7％），可以作為實時定量PCR的替代檢測工具，并且也已存在相應(yīng)的試劑盒［22］。需要強調(diào)的是該技術(shù)應(yīng)

用于檢測幽門螺桿菌克拉霉素耐藥性在韓國已進入臨床試驗（NCT01453036）［23］。M icroarray是比較熱門的高通量檢測技術(shù)，近幾年也用于簡單快速檢測H.pylori感染并同時檢測其致病性相關(guān)的基因型及耐藥性。該技術(shù)主要依賴于特異性探針的設(shè)計［20］。基于酶比色法建立的DNA芯片可直接對胃組織進行檢測，其結(jié)果與DNA測序的結(jié)果具有96.83％的一致性，同時靈敏度可達1.53×102copy／m L［24］。GenoType HelicoDR是基于另一成功應(yīng)用于結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測的試劑盒（GenoType MTBDR）而開發(fā)的新型基因檢測方法［21］。該方法屬于DNA條帶技術(shù)，后者基于多重PCR與反向雜交的結(jié)合，成本相對低廉且易于操作，敏感性和特異性很高［21，25］，可分別達94％和99％，陽性和陰性預(yù)測值分別為99％和94％［21］。最近，該方法已被南非用來開展整個國家的H.pylori抗生素耐藥性檢測［26］。

1.2 甲硝噠唑

甲硝噠唑?qū)儆谙趸溥蝾惪股兀且环N廉價的藥物。甲硝噠唑耐藥機制涉及rdxA基因的不同突變，這些突變使電子傳遞鏈組件煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinam ide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）硝基還原酶失去活性，進而無法激活甲硝噠唑產(chǎn)生硝基陰離子自由基、亞硝基衍生物和羥氨以破壞DNA螺旋結(jié)構(gòu)。這也是引起H.pylori甲硝噠唑耐藥的可能主要機制，但是rdxA基因涉及的突變數(shù)目和類型較多、缺少規(guī)律性［27］，這增加了甲硝噠唑的耐藥基因檢測的難度。此外，研究表明甲硝噠唑耐藥還涉及其他還原酶的失活［28］。

總體上說，只在DNA水平上檢測甲硝噠唑耐藥性還不能指導(dǎo)用藥。爾后發(fā)現(xiàn)，從RNA水平上檢測相關(guān)基因是甲硝噠唑耐藥性檢測的一種準確方法［29］，而從蛋白質(zhì)水平檢測甲硝噠唑耐藥性也已在臨床菌株中得到了驗證，后者如RdxA蛋白質(zhì)的缺失可以快速確定大多數(shù)臨床甲硝噠唑耐藥株［30］。

1.3 阿莫西林

阿莫西林屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素大類中的青霉素類抗生素，具有很高的殺菌活性，可包含在用于H.pylori根除的所有治療方案中［1］。穩(wěn)定的阿莫西林耐藥性涉及不同的機制［31－32］。其中，青霉素結(jié)合蛋白基因1A（pbp 1A）突變是穩(wěn)定H.pylori阿莫西林耐藥的常見機制，該基因的突變降低或消除了阿莫西林與青霉素結(jié)合蛋白的親和性，后者在細胞壁的合成過程中具有重要作用［33］。此外，關(guān)于其他青霉素結(jié)合蛋白（PBP2和PBP3）的編碼基因突變，也可能都與阿莫西林耐藥有關(guān)［32］。雖然絕大多數(shù)研究表明β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生在H.pylori內(nèi)并不活躍，但已有研究發(fā)現(xiàn)了由內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生引起的H.pylori阿莫西林耐藥性，該耐藥機制通常會引起高水平耐藥（≥256mg／L）［31］，因此，對H.pylori有必要進行該耐藥基因的監(jiān)控，以有效控制該基因的水平傳播。

令人遺憾的是，目前鮮有關(guān)于阿莫西林耐藥性基因檢測方法的報道，可能有以下幾個原因。首先，盡管研究表明pbp 1基因的突變是穩(wěn)定H.pylori阿莫西林耐藥的常見機制，但是涉及的突變類型和突變數(shù)量較多，且該機制引起的耐藥水平較低。其次，內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生引起的H.pylori阿莫西林耐藥性雖然很高，但該機制的發(fā)生較罕見［31］。最后，膜通透性降低或阿莫西林外排泵系統(tǒng)作為高水平阿莫西林耐藥性的可能機制，涉及的突變并未明確［34］。

總之，基因檢測方法應(yīng)用于阿莫西林耐藥性的檢測需要對相關(guān)耐藥機制，特別是pbp 1基因突變更加深刻的理解。盡管如此，據(jù)報道與H.pylori阿莫西林耐藥性有關(guān)的絕大多數(shù)突變位于或臨近PBP第二和第三個關(guān)鍵序列。其中PBP1 SKN關(guān)鍵序列附近的Ser414 Arg、位于PBP1 KTG關(guān)鍵序列中心的Thr556Ser以及臨近PBP1 KTG關(guān)鍵序列的Asn562Tyr和Thr593Ala是比較重要的常見替換突變［35－36］，或許是基因檢測方法的理想靶點。

2 二線治療或補救治療藥物耐藥基因檢測

2.1 左氧氟沙星

左氧氟沙星作為新一代氟喹諾酮類，具有廣譜抗菌作用，在一線療法、甚至二線療法失敗后的補救治療中效果理想，用左氧氟沙星來根除H.pylori的方案正在世界范圍內(nèi)得到推廣［37］。gyrA喹諾酮類藥物耐藥性決定域（QRDR）上的點突變可阻止左氧氟沙星與DNA促旋酶（包括亞單位A和亞單位B，分別由gyrA和gyrB編碼）的結(jié)合，引起細菌的耐藥［38］。此外，最近的研究已確定gyrB上的突變，Glu463Gly，是引起H.pylori氟喹

諾酮類耐藥的另一新的機制［39］。

至今，關(guān)于氟喹諾酮類藥物耐藥性的分子檢測方法可包括實時定量PCR、等位基因特異性PCR（allele specific polymerase chain reaction，

AS-PCR）和最近的GenoType HelicoDR［21，40－41］。實時定量PCR采用的是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）熔解曲線分析方法（FRET-RT-PCR）。根據(jù)熔解溫度的差異，該方法可以快速識別出主要突變（gyrA）包括Asn87Lys、Asp91Gly、Asp91Asn、Asp91Tyr［40］。AS-PCR是一種比較簡單的方法，可在3～4小時內(nèi)完成檢測，其能夠檢測的突變形式與實時定量PCR相同［41］。GenoType HelicoDR作為已經(jīng)上市的試劑盒，在檢測左氧氟沙星耐藥性方面具有不錯的表現(xiàn)，是目前針對左氧氟沙星耐藥性較為理想的基因檢測方法。該方法檢測時間不到6小時，可準確地檢測較多的突變，包括Asn87Lys、Asp91Gly、Asp91Asn、Asp91Tyr、Asp86Asn、Thr87Tyr，前4種為主要檢測對象。該方法可直接對胃活檢標本進行檢測，無需培養(yǎng)，且敏感性、特異性、陽性和陰性預(yù)測值分別可達83％、95％、91％和91％［21，25］。最近在南非對H.pylori的抗生素耐藥性調(diào)查中，該方法被證明可以簡單、快速地確定左氧氟沙星耐藥發(fā)生率（10.26％）［26］。

2.2 四環(huán)素

圖1 幽門螺桿菌常用抗生素主要耐藥機制Figure 1 Main resistancemechanisms ofmost-commom ly used antibiotics for H.pylori eradication

四環(huán)素是常常作為二線治療方案、特別是四聯(lián)療法中的基本抗生素。雖然該藥物的細菌耐藥性并不常見，但似乎在不斷增加。四環(huán)素耐藥性主

要由16S rRNA內(nèi)四環(huán)素初級結(jié)合位點（Tet-1）的點突變引起，這些突變導(dǎo)致四環(huán)素與30S核糖體亞基親和力降低［42］。

關(guān)于四環(huán)素耐藥性的基因檢測方法的報道目前僅涉及PCR-RFLP和實時定量PCR兩種方法。其中PCR-RFLP僅對三重突變AGA926-928TTC進行檢測。該方法可以將高水平四環(huán)素耐藥菌株從低水平耐藥菌株中區(qū)分開，因而可以作為四環(huán)素耐藥性快速篩查方法［43］。然而，最近的研究表明，對其他突變的檢測也是有必要的，盡管這些突變通常引起的耐藥性水平較低［44］。通過熔點溫度分析，實時定量PCR不僅可以鑒別最重要的三重突變AGA926-928TTC，而且也可以檢測二重突變?nèi)鏏GA926-928GGC、AGA926-928GTA、AGA926-928TTA、AGA926-928ATC、AGA926-928TGC，以及單突變?nèi)鏏GA926-928ATA、AGA926-928GGA。同時，此方法不僅可應(yīng)用于從培養(yǎng)液提取的DNA，而且也可以直接應(yīng)用于從新鮮或冷凍胃活檢樣本提取的DNA，大大縮短診斷時間［45］。實驗表明，該方法的敏感度可達每微升含10個基因組拷貝H.pylori，且無特異性問題［45］。最近的研究表明，該方法與傳統(tǒng)方法相比的一致性可達97％［46］。

表1 幽門螺桿菌耐藥性基因檢測突變和方法匯總Table 1 Summary of mutations and methods for antibiotic resistance genes detection of H.pylori

3 三線治療或補救治療藥物耐藥基因檢測

3.1 利福平和利福布汀

利福平和利福布汀屬于利福平類抗生素，與氟喹諾酮類抗生素一樣，此類藥物一般用于H.pylori感染的補救治療。利福平／利福布丁耐藥性與rpoB基因的突變有關(guān)，其編碼RNA聚合酶β亞基［47］。

由于利福平類抗生素耐藥率還處于非常低的水平，且該藥物一般只用于H.pylori感染的補救治療，目前還沒有關(guān)于利福平類抗生素耐藥性基因檢測的報道。不過，重要的突變位置位于525-545氨基酸處（Leu525Pro、Gln527Lys、Gln527Arg、Asp530Val、Asp530Asn、His540Tyr、His540Asn、Ser545Leu）和585氨基酸處（Ile586Asn、Ile586Leu）［47－49］。

4 總結(jié)與展望

不可否認，越來越多基因檢測方法已應(yīng)用于H.pylori抗生素耐藥性的篩查，其中，針對克拉霉素耐藥性的基因檢測和診斷已臻于成熟。然而，總體上講，H.pylori抗生素耐藥性基因檢測的效果有待于改善，還有許多問題需要解決。比方說，關(guān)于甲硝噠唑耐藥性和阿莫西林的基因檢測仍是個難點，更加深入的耐藥機制研究和更加高效的基因檢測方法將有助于該問題的解決。至于其他抗生素，如利福平類抗生素，雖然其耐藥率還很低，但不能排除應(yīng)用基因檢測方法對其進行快速及時監(jiān)控的必要性。更重要的是，目前H.pylori抗生素耐藥性基因檢測僅僅針對較為明確的耐藥機制和突變，同時檢測的抗生素種類和突變范圍也有限，以

及鮮有涉及外排泵系統(tǒng)或膜通透性耐藥機制，因而這種檢測還需要在這些方面改進。另外，關(guān)于具體的突變與臨床H.pylori抗生素耐藥水平的定量關(guān)系也需要進一步的闡明。至于具體的基因檢測方法，實時定量PCR是目前比較理想的基因檢測方法。然而，該方法還是很難達到同時進行多種抗生素耐藥性、多基因靶點分析的需要，昂貴的維護和檢測成本也限制了該方法的大規(guī)模的應(yīng)用。值得注意的是，目前測序技術(shù)，尤其是高通量測序技術(shù)（二代測序技術(shù)和三代測序技術(shù)），雖然還很少應(yīng)用于幽門螺桿菌抗生素耐藥性基因檢測，但是隨著測序成本的不斷降低和測序時間的不斷縮減，相信高通量測序?qū)谟拈T螺桿菌耐藥性基因檢測方面充分發(fā)揮其用武之地。因此，除了更加深入的耐藥機制研究以外，更加全面、高效、快速、低廉、高通量、多靶點檢測技術(shù)是未來H.pylori抗生素耐藥性基因檢測的發(fā)展方向。

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Antibiotic resistance genes detection of Helicobacter pylori:the next step?

LIYunzhen1,2,GE Anguo3★,WANG Qingbo1,GAO Hongzhi4,WANG M ingxi1★,HUWeipeng4★
(1.Yun Leung Laboratory for Molecular Diagnostics,School of Biomedical Science and Institute of Molecular Medicine,Huaqiao University and Engineering Research Center of Molecular Medicine,Ministry of Education, Xiamen,Fujian,China,361021；2.Wenzhou Institute of Biomaterials and Engineering,Wenzhou,Zhejiang, China,325011；3.Linyi Rongjun Hospital,Linyi,Shandong,China,276005；4.Research Center,The 2nd Affliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou,Fujian,China,362000)

Antibiotic resistance of Helicobacter pylori is themost important reason for failure of its eradication.Overall prevalence of related antibiotic resistance in the region should be also considered for an effective treatment.It is clinically important to detect H.pylori antibiotic resistance efficiently andmonitor its incidence in local population timely.With themechanisms of antibiotic resistance for H.pylori becoming clear gradually,more diagnostic methods,especially themolecular technologies come to the fore.In this review,the main resistancemechanisms of themost commonly used antibiotics in H.pylori eradication therapy were briefly discussed and the progresses in molecular diagnostic technologies were emphaticallysummarized,which may provide theoretical guidance and practical reference formolecular diagnosis of H.pylori antibiotic resistance.

Helicobacter pylori；Antibiotic resistance；Resistance gene detection

福建省科技廳重大項目（2012Y4009）；福建省自然科學(xué)基金（2011J01220）；福建省教育廳資助課題（JA09118）；廈門市科技計劃（3502Z20123036）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（12J0445*，13J0493*）；華僑大學(xué)引進人才科研啟功費（12Y0317*）；泉州市科技項目（No.2010Z87）

1.華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院＆分子藥物研究院＆分子藥物教育部工程研究中心，潤良分子診斷研究室，福建，廈門361021 2.溫州生物材料與工程研究所生物材料事業(yè)部，浙江，溫州325011 3.山東省臨沂市榮軍醫(yī)院，山東，臨沂276005 4.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，中心實驗室，福建，泉州362000

★通訊作者：葛安國，E-mail：geanguo＠126.com；王明席，E-mail：mxwang＠hqu.edu.cn；胡偉鵬，E-mail：hwplcj＠sina.com

注：李云振，葛安國為并列第一作者