姜黃素增加U937細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性的凋亡機(jī)制研究

焦衛(wèi)云，陳道俊，柯章敏，鮑楊漪

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，安徽合肥 230001;2.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽合肥 230032)

白血病是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，化療藥物的耐藥及較大的毒副反應(yīng)使白血病的治療效果欠佳，導(dǎo)致腫瘤易復(fù)發(fā)且患者遠(yuǎn)期生存率不高［1］。姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種有效化學(xué)成分，大量研究證實(shí)其具有抗炎，抗氧化，抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制，促進(jìn)凋亡，抑制血管生成等效應(yīng)，然而其具體機(jī)制尚不清楚［2］。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)配體 DR4，DR5，DcR1，DcR2結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)功能且對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，是治療腫瘤一種具有良好前景的藥物［3-4］。本課題研究姜黃素聯(lián)合TRAIL對(duì)白血病U937細(xì)胞的凋亡的影響，同時(shí)觀察DR5的表達(dá)變化，旨為白血病的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人白血病細(xì)胞株U937購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物庫(kù)。姜黃素(美國(guó) Sigma公司，純度 ＞99%);IMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司，MTT和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自碧云天公司，凋亡檢測(cè)試劑盒為貝博公司產(chǎn)品，DR5抗體購(gòu)自BD公司，重組人TRAIL購(gòu)自eBiosicence公司，流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 U937細(xì)胞株培養(yǎng) 在含10%胎牛血清、雙抗(100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素)的IMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 對(duì)細(xì)胞增殖抑制的檢測(cè) 采用常規(guī)MTT法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937，以2×104/孔細(xì)胞接種96孔板，加入終濃度為 5、10、20、40 μmol·L-1的姜黃素及 1、10、100、1 000 μg·L-1的TRAIL，同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)孵育24 h，繼續(xù)檢測(cè)前加入20μL的MTT，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去上清，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10 min，經(jīng)酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)相應(yīng)的吸光度(A)，抑制率 =(對(duì)照組 A值 -實(shí)驗(yàn)孔 A值)/對(duì)照組 A值 ×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞以109·L-1接種于6孔板，10μg·L-1的TRALL聯(lián)合加入姜黃素(5、10、20、40 μmol·L-1)，設(shè)不加藥組為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后，收集各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，用PBS洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1010·L-1，加入3只離心管，每管100μL細(xì)胞懸液，分別加入5μL PI及10μL Annexin V的熒光抗體，避光孵育15 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 蛋白免疫印跡雜交 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，配成1011·L-1細(xì)胞懸液，接種于6孔板，10μg·L-1的TRALL聯(lián)合加入姜黃素(終濃度分別為10、20、40μmol·L-1)，設(shè)不加藥組為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集U937細(xì)胞，用 PBS 洗滌 3 次，1 800 r·min-1離心 10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀內(nèi)加入強(qiáng)效細(xì)胞裂解液300μL和蛋白酶抑制劑3 μL，冰上裂解30 min，取上清置于EP管內(nèi)，4℃ 12 000 g離心15 min，收集上清作為總蛋白，考馬斯亮藍(lán)定量試劑盒進(jìn)行蛋白檢測(cè)，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，雙蒸水配平，每管加入蛋白處理液30μL，混勻煮沸5 min，按每泳道蛋白樣品40 μg加入SDS-PAGE樣品孔內(nèi)，電泳后半干電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，一抗(鼠抗人DR5)、二抗孵育及顯色、掃描條帶，Imagel軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)觀測(cè)資料，主要為計(jì)量資料，以±s表示，均行正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較方法為L(zhǎng)SD檢驗(yàn)。兩獨(dú)立組間的比較為成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素、TRAIL對(duì)U937的作用結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5～40μmol·L-1的姜黃素對(duì)U937有明顯的細(xì)胞增殖抑制作用，加藥組的增殖抑制作用顯著高于對(duì)照組(5μmol·L-1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同濃度的 TRAIL作用24 h后，其對(duì)U937無(wú)明顯增殖抑制作用，與對(duì)照組(1 μg·L-1)比較，除最高的劑量組(B4)外，差異多無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

表1 姜黃素及TRAIL對(duì)U937細(xì)胞的增殖抑制率(±s)

注:單因素方差分析。

A:姜黃素/μmol·L-1 24 h觀測(cè)值(n=9)B:TRAIL/μg·L-1 24 h觀測(cè)值(n=9)空白組 A0:0.0 0.5 ±0.1 B0:0.0 0.5 ±0.1對(duì)照組 A1:5.0 5.9 ±1.2 B1:1.0 4.6 ±1.8劑量組 A2:10.0 18.7 ±3.6 B2:10.0 5.6 ±2.4 A3:20.0 29.4 ±5.1 B3:100.0 6.9 ±2.9 A4:40.0 42.8 ±6.9 B4:1000.0 8.7 ±3.5整體分析:F，P 99.191，0.000 3.859，0.018多重比較 A2 vs A1 5.778，0.000 B2 vs B1 0.762，0.452:LSD-t，P A3 vs A1 10.558，0.000 B3 vs B1 1.803，0.081 A3 vs A2 4.780，0.000 B3 vs B2 1.041，0.306 A4 vs A1 16.574，0.000 B4 vs B1 3.208，0.003 A4 vs A2 10.796，0.000 B4 vs B2 2.446，0.020 A4 vs A3 6.016，0.000 B4 vs B3 1.405，0.170

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)U937細(xì)胞的凋亡率 U937細(xì)胞經(jīng)1、10、100、1 000 μg·L-1的 TRAIL 作用24 h 無(wú)凋亡發(fā)生，5、10、20、40 μmol·L-1的姜黃素作用 24 h 的凋亡率分別為(4.7 ± 0.7)%、(9.8 ± 1.2)%、(15.6 ± 3.1)%、(24.8 ±4.5)%，10 μg·L-1的 TRAIL 聯(lián)合 5、10、20、40 μmol·L-1的姜黃素作用24 h的凋亡率分別為(15.6±1.5)%、(26.7±3.5)% 、(49.7 ±6.5)% 、(76.7 ±10.5)%，與相應(yīng)單獨(dú)姜黃組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 姜黃素單獨(dú)或聯(lián)合TRAIL對(duì)U937細(xì)胞的凋亡率(±s)

表2 姜黃素單獨(dú)或聯(lián)合TRAIL對(duì)U937細(xì)胞的凋亡率(±s)

注:姜黃素濃度如表中所示，TRIL濃度為10.0μg·L-1。比較方法為成組t檢驗(yàn)。

n 對(duì)照組 5 μmol·L-1 10 μmol·L-1 20 μmol·L-1 40 μmol·L -1姜黃素94.3 ±0.5 4.7 ±0.7 9.8 ±1.2 15.6 ±3.1 24.8 ±4.5姜黃素 +TRAIL 9 4.7 ±0.6 15.6 ±1.5 26.7 ±3.5 49.7 ±6.5 76.7 ±10.5兩組相比 t，P 1.536，0.144 19.755，0.000 13.703，0.000 14.206，0.000 13.630，0.000

2.3 WB法檢測(cè)DR5表達(dá)率 10μg·L-1的TRALL聯(lián)合10、20、40 μmol·L-1的姜黃素作用 24 h 后的 U937 細(xì)胞，其DR5蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與空白對(duì)照組比較有明顯不同。參見圖1。

3 討論

白血病是造血干細(xì)胞因分化阻滯，凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，目前白血病的治療仍以化療為主，然而腫瘤的耐藥及較強(qiáng)的毒副作用使80%左右的患者復(fù)發(fā)［5］。

近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療白血病方面取得了一定的療效。姜黃素使從姜科植物中藥姜黃的地下根莖中分離出來(lái)的具有廣泛生物活性的物質(zhì)［6］。在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化，抗感染和抗腫瘤的生物學(xué)活性。研究證實(shí)姜黃素在體外可以協(xié)同5-氟尿嘧啶，全反式維甲酸，順鉑，塞來(lái)昔布，柔紅霉素等對(duì)結(jié)腸癌，胃癌，肝癌，宮頸癌，前列腺癌等多種細(xì)胞株具有協(xié)同殺傷效應(yīng)［7-8］。大量研究證實(shí)姜黃素通過(guò)抑制NF-κB活性，抑制轉(zhuǎn)錄增殖相關(guān)基因(cyclin D1)，抗凋亡相關(guān)基因(XIAP，survivin)等抑制耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥(MDR)，為姜黃素單獨(dú)或聯(lián)合其它化療藥物逆轉(zhuǎn)MDR，減輕化療的不良反應(yīng)提供了強(qiáng)有力的依據(jù)［9］。另有研究進(jìn)一步證實(shí)姜黃素逆轉(zhuǎn)的MDR，可能是通過(guò)抑制腫瘤抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，恢復(fù)Smac蛋白的釋放，從而打開內(nèi)源性凋亡途徑，經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)白血病U937細(xì)胞具有明顯的增殖抑制及促凋亡作用，提示姜黃素單藥可能對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有溶瘤效應(yīng)，為姜黃素在臨床中的使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

TRAIL屬于腫瘤壞死因子家族，其與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)配體DR4，DR5，DcR1，DcR2結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞株發(fā)生凋亡，且對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，是治療腫瘤一種具有良好前景的藥物。TRAIL與激活型受體DR4，DR5結(jié)合后，募集Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)，procaspase-8形成死亡復(fù)合物，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)，最終激活下游caspase-3，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。誘騙受體DcR1和DcR2缺乏完整的胞內(nèi)段，競(jìng)爭(zhēng)性與TRAIL結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡［10］。研究發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌患者中，10.6%的患者DR5死亡結(jié)構(gòu)域的基因發(fā)生突變，在頭頸部腫瘤中也驗(yàn)證了同樣的改變，表明死亡受體的突變可能參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。另有研究證實(shí)在某些對(duì)TRAIL抵抗的腫瘤細(xì)胞中，其表面激活型受體表達(dá)下調(diào)，誘騙型受體上調(diào)或細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白(Bcl-2，c-FLIP等)的高表達(dá)，致其對(duì)TRAIL不敏感。我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)TRAIL對(duì)U937細(xì)胞無(wú)任何毒性。因此，如何增敏TRAIL對(duì)腫瘤的殺傷研究尤為迫切。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低劑量TRAIL聯(lián)合不同濃度的姜黃素可顯著提高對(duì)腫瘤的殺傷，經(jīng)流式細(xì)胞儀及免疫蛋白印跡法檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度的姜黃素作用24 h后的U937細(xì)胞，其表面及細(xì)胞內(nèi)的DR5蛋白明顯上調(diào)，表明姜黃素增敏TRAIL對(duì)U937的殺傷可能是通過(guò)上調(diào)DR5而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，TRAIL對(duì)惡性腫瘤的治療具有廣闊的前景，然而腫瘤細(xì)胞是否對(duì)其敏感將直接影響其療效，因此如何聯(lián)合其它藥物增敏腫瘤對(duì)其殺傷成為免疫細(xì)胞治療成功的關(guān)鍵。本研究證實(shí)中藥提取物姜黃素通過(guò)上調(diào)DR5可增加白血病U937細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，為臨床治療復(fù)發(fā)性白血病提供了新的思路，然而其協(xié)同作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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