UPLC法測(cè)定白花蛇舌草注射液中對(duì)香豆酸的含量

汪曉娟，張亞中

(1.安徽省阜陽(yáng)市人民醫(yī)院，安徽 阜陽(yáng) 236000;2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051)

白花蛇舌草注射液為白花蛇舌草經(jīng)提取制成的單味藥滅菌水溶液，用于濕熱蘊(yùn)毒所致的各種感染，亦可用于癌癥輔助治療。本次試驗(yàn)共收集到吉林省通化振國(guó)藥業(yè)有限公司、安徽鳳陽(yáng)科苑有限公司和江西天施康中藥股份有限公司的13批產(chǎn)品?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于部標(biāo)第十七冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容包括性狀、理化鑒別、TLC、pH及制劑通則檢查、總黃酮含量測(cè)定。文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)香豆酸是其活性成分之一［1-3］，關(guān)于對(duì)香豆酸的測(cè)定一般采用普通高效液相色譜法測(cè)定［4-7］，但該方法分析時(shí)間較長(zhǎng)，本文研究了用UPLC法測(cè)定白花蛇舌草注射液中對(duì)香豆酸的含量，方法簡(jiǎn)單，快速，分離度較好。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜儀(Waters公司);色譜柱:ACQUITY UPLCBEH C18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)。

乙腈:Merck，色譜級(jí);冰醋酸:Tedia，色譜級(jí);純凈水為MILLI-Q純水。

白花蛇舌草注射液:安徽鳳陽(yáng)科苑有限公司，批號(hào):101129，110326，110325;吉林省通化振國(guó)藥業(yè)有限公司，批號(hào):110106，100907，110705，110704;江西天施康中藥股份有限公司，批號(hào):10110301，10010812，11010101，11031401，11020402，11051403。

對(duì)香豆酸對(duì)照品(批號(hào)11052132)，上海同田生化有限公司提供，含量為98.0%。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，以 0.3%醋酸(A)—甲醇(B)為流動(dòng)相，按表1進(jìn)行梯度洗脫，柱溫 20℃，流速 0.4 mL·min-1。

2.2 溶液制備 取對(duì)香豆酸對(duì)照品適量，精密稱定，用50%甲醇制成每1 mL含20μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

精密量取白花蛇舌草注射液1 mL置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取上述溶液各2μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用PDA檢測(cè)器進(jìn)行全波段掃描，提取PDA掃描圖譜，比較分析。結(jié)果顯示:對(duì)香豆酸對(duì)照品溶液在308 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇308 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) (1)理論板數(shù)(n)的測(cè)定:取對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀中，結(jié)果見圖2，測(cè)得n=9 736，考慮到不同色譜柱之間的差異，將理論板數(shù)訂為不得少于4 000。(2)精密度:精密量取對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積的測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%(應(yīng)≤2.0%)，符合藥典規(guī)定。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 按處方組成，取除白花蛇舌草藥材的輔料，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備陰性對(duì)照溶液。在上述色譜條件下，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，見圖1。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和線性范圍的考查 精密量取濃度為 16.78 mg·L-1的對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、1、2、4 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)香豆酸進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y=293.39X+10.956(n=6，r=0.999 996)。結(jié)果表明:對(duì)香豆酸在1.678 ～67.12 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，在室溫下放置，每隔一定時(shí)間后進(jìn)樣一次，進(jìn)行測(cè)定，12 h內(nèi)，峰面積的RSD為0.3%。結(jié)果表明:樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)為10010812)6份，分別依法制成供試品溶液，測(cè)定對(duì)香豆酸的平均含量為0.17 g·L-1(RSD=0.3%)。結(jié)果表明:本法重現(xiàn)性良好。

2.3.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)為10010812)6份，每份 0.5 mL，精密加入濃度為 0.805 g·L-1的對(duì)照品溶液0.1 mL，依法制成供試品溶液，測(cè)定對(duì)香豆酸的含量，計(jì)算平均回收率為99.8%(RSD=0.7%)。本法準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品測(cè)定 取收集的樣品13批，分別按正文方法測(cè)定對(duì)香豆酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果

13批樣品均檢出了對(duì)香豆酸，但不同廠家的平均含量差異較大，安徽鳳陽(yáng)科苑藥業(yè)有限公司、吉林省通化振國(guó)藥業(yè)有限公司和江西天施康中藥股份有限公司的平均值分別為0.047、0.353和0.228 g·L-1，13 批樣品的平均含量為 0.224 g·L-1，這種差異可能與不同生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)工藝不統(tǒng)一有關(guān)，因此暫訂對(duì)香豆酸的含量為不少于0.224×(1-20%)=0.18 g·L-1為宜，建議各生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)盡快統(tǒng)一生產(chǎn)工藝，消除這種差異，以保證產(chǎn)品的有效性和均一性。

3 討論

3.1 UPLC的色譜條件優(yōu)化 課題組在前期的研究中采用HPLC，流動(dòng)相為醋酸水溶液(pH3.2)—甲醇(95∶5)(A)—乙腈(B)系統(tǒng)，對(duì)香豆酸的出峰時(shí)間為35 min，全部色譜峰出完的時(shí)間為70 min，時(shí)間較長(zhǎng)。后采用UPLC，考慮到HPLC的流動(dòng)相體系較為復(fù)雜，流動(dòng)相改用了0.3%醋酸(A)—甲醇(B)體系，兩者的峰型較為類似，因此 UPLC采用了0.3%醋酸(A)—甲醇(B)體系。在UPLC測(cè)定研究中先采用了等度洗脫，對(duì)香豆酸可在5 min出峰，分離度良好，但其他色譜峰分離度較差，不符合指紋圖譜的要求，考慮到整個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還需建立指紋圖譜，因此本文采用了梯度洗脫，既能滿足指紋圖譜的要求，也可用于含量測(cè)定。

3.2 超高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn) 超高效液相色譜(UPLC)［9］，與傳統(tǒng)的 HPLC 技術(shù)相比，提供了更高的效率，因而具有更強(qiáng)的分離能力，在藥物分析上正有越來(lái)越多的應(yīng)用。本試驗(yàn)將高效液相色譜用于白花蛇舌草注射液的含量測(cè)定，與普通HPLC采用C18填料的色譜柱比較，其分析速度提高了5倍以上，且具有較高的分析通量。

3.3 白花蛇舌草注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問題 白花蛇舌草注射液的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，不能保證白花蛇舌草注射液的安全性和有效性，課題組已經(jīng)對(duì)白花蛇舌草注射液進(jìn)行了一些研究［10-12］，還有待進(jìn)一步研究，為制定一個(gè)能體現(xiàn)白花蛇舌草注射液安全性和有效性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)打下基礎(chǔ)。

［1］朱立俏.白花蛇舌草的化學(xué)成分和抗腫瘤活性的研究進(jìn)展［J］.化工時(shí)刊，2012，26(10):37-41.

［2］于 莉.白花蛇舌草抗腫瘤活性成分的研究［D］.沈陽(yáng):沈陽(yáng)藥科大學(xué)，2009.

［3］周應(yīng)軍，吳孔松，曾光堯，等.白花蛇舌草化學(xué)成分的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(7):590-593.

［4］張才華，郭興杰，薛秀峰，等.HPLC測(cè)定白花蛇舌草注射液中對(duì)香豆酸的含量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2004，39(11):854-855.

［5］郭云珍，寶爐丹，潘永興，等.HPLC同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草注射液中2種成分的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(8):1158-1160.

［6］張洪飛，張華燕，李 燕，等.反相HPLC同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草口服液中4種組分含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(20):2329-2331.

［7］晏利芝，王英鋒，余啟榮.HPLC同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草有效部位中對(duì)香豆酸和反式6-O-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯的含量［J］.中國(guó)新藥雜志，2012，21(13):1554-1557.

［8］唐旭利，劉 靜，李國(guó)強(qiáng)，等.不同產(chǎn)地白花蛇舌草中對(duì)香豆酸含量測(cè)定的快速方法［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25(5):408-410.

［9］許元寶.UPLC法測(cè)定葛丹顆粒中葛根素的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(2):210-211.

［10］張亞中.基于超高效液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的白花蛇舌草注射液主成分分析［J］.中草藥，2013，44(7):829-833.

［11］劉 驊.不同來(lái)源白花蛇舌草注射液過敏反應(yīng)比較研究［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(6):939-940.

［12］劉軍玲，張亞中.離子色譜法測(cè)定白花蛇舌草注射液中亞硫酸鹽與硫酸鹽總量［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(5):769-770.