HPLC-MSMS測(cè)定小柴胡顆粒中柴胡皂苷a與柴胡皂苷d

王嘉林，王斯坦

(1.河南省洛陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南洛陽 471023;2.無錫瑞年實(shí)業(yè)有限公司，江蘇無錫 214092)

小柴胡顆粒為小柴胡湯的成方現(xiàn)代制劑，小柴胡湯由柴胡、黃芩、半夏、黨參、生姜、甘草、大棗組成，來源于東漢名醫(yī)張仲景《傷寒論》，主要功用為解表散熱，疏肝和胃，用于外感病邪犯少陽證。小柴胡顆粒收載于《中國藥典》2010年版藥典一部，柴胡在方中占30%，為君藥，為小柴胡顆粒指標(biāo)性藥材，藥典只對(duì)柴胡進(jìn)行定性鑒別，含量測(cè)定只是對(duì)黃芩苷進(jìn)行測(cè)定，柴胡中主要含有揮發(fā)油、黃酮及皂苷類，其中柴胡皂苷a(SSa)與柴胡皂苷d(SSd)為藥典中柴胡藥材項(xiàng)下質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)構(gòu)式見圖1，據(jù)報(bào)道柴胡皂苷具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、保肝的作用［1-3］，SSa與SSd遇酸與光不穩(wěn)定，易使環(huán)氧醚鍵開環(huán)［4］，轉(zhuǎn)變?yōu)椴窈碥?b1、b2。小柴胡顆粒制法遵循古方煎煮，揮發(fā)油部分并未含在內(nèi)，而經(jīng)過煮制并制粒后柴胡復(fù)方中SSa與SSd的含量如何評(píng)價(jià)成為亟需解決的問題，由于柴胡皂苷無紫外吸收，已有文獻(xiàn)對(duì)柴胡皂苷測(cè)定大多采用203～210 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定［5-6］，末端吸收下色譜峰干擾嚴(yán)重，筆者參照文獻(xiàn)［7］，采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)復(fù)雜柴胡組方小柴胡顆粒中柴胡皂苷進(jìn)行含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)單可靠，可有效控制小柴胡顆粒的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜，G1312B二元高壓泵，G1322A真空在線脫氣機(jī)，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G6410A三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(US)，Masshunter工作站，Metter Toledo XP205十萬分之一電子分析天平(Swizerland)。

1.2 試藥 柴胡皂苷a對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110777-201309，供含量測(cè)定用，含量92.0%)，柴胡皂苷d(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào) 110778-201208，供含量測(cè)定用，含量94.6%)，小柴胡顆粒(購自市售不同廠家共6個(gè)批次)，甲醇(DIKMA 色譜純)，乙腈(MERCK 色譜純)，乙酸銨(FLUKA色譜純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 液相條件:Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(4.6 mm × 100 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相:乙腈—0.05%乙酸銨(40∶60)，流速:0.4 mL·min-1，柱溫:30℃，進(jìn)樣量3μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，毛細(xì)管電壓3 300 V，干燥器溫度 340℃，干燥氣流量 12 L·min-1，霧化器壓力40 psi，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 柴胡皂苷a與柴胡皂苷d質(zhì)譜參數(shù)

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取柴胡皂苷a與柴胡皂苷d約10 mg，置10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解，并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，放冰箱-20℃下冷凍。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取小柴胡顆粒樣品1 g置錐形瓶中，加5%氨水的甲醇溶液50 mL，稱定，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足減失重，搖勻，過濾，精密移取2 mL續(xù)濾液置25 mL量瓶中，用5%氨水的甲醇溶液定容至刻度，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性樣品 依照藥典處方比例缺柴胡制備陰性樣品，同時(shí)依照“2.2.2”項(xiàng)下樣品處理方法處理，進(jìn)樣，得陰性樣品TIC圖，無干擾。見圖2。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取1 mL“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液至100 mL量瓶，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，作為工作儲(chǔ)備液。同步稀釋成10、20、50、100、250、500、1 000 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。按照2.1項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣，以樣品濃度X為橫坐標(biāo)，以質(zhì)譜響應(yīng)面積Y為縱坐標(biāo)，擬合曲線得，柴胡皂苷a的線性回歸方程為Y=9.785 X-0.510 2，r=0.999 0，柴胡皂苷 d 的線性回歸方程為 Y=31.516X-3.16，r=0.991 2。見圖 2。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法，平行制備6份供試品溶液(樣品編號(hào)1)，分別進(jìn)樣3μL，柴胡皂苷a的RSD為1.84%，柴胡皂苷d的RSD為1.91%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(樣品編號(hào)1)，分別于0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，每次進(jìn)樣3μL，柴胡皂苷a的RSD為2.0%，柴胡皂苷 d的RSD為1.58%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下柴胡皂苷混合對(duì)照品溶液(10，100，1 000 μg·L-1水平濃度)3μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算所得定量離子RSD面積，計(jì)算RSD，結(jié)果見表2，表明精密度良好。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)表

2.3.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的小柴胡顆粒樣品(樣品編號(hào)2)1 g，共6份，分別精密加入一定量的柴胡皂苷a和d的對(duì)照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率柴胡皂苷a(n=6)為99.1%，RSD為1.6%，柴胡皂苷 d(n=6)為 98.7%，RSD 為1.4%。結(jié)果見表3。

表3 小柴胡顆粒加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.3.7 樣品的測(cè)定 取所購6個(gè)不同批次的小柴胡顆粒樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣3μL，計(jì)算含量結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 柴胡皂苷的質(zhì)譜裂解行為 在方法優(yōu)化時(shí)進(jìn)樣柴胡皂苷a與柴胡皂苷d對(duì)照品，得到豐度最高的峰為m/z 803峰，分析為［M+Na］+峰，選擇負(fù)離子模式則加鈉峰豐度減小，柴胡皂苷a與d都連接有葡萄糖與半乳糖，增加CID電壓，柴胡皂苷a與d發(fā)生不同裂解，柴胡皂苷a失去一個(gè)葡萄糖得到豐度最高離子m/z 617，與第二豐度m/z 161.1離子，而柴胡皂苷d得到第一豐度離子m/z 617與定性離子m/z 145，兩個(gè)化學(xué)成分定量離子相同，但定性離子不同，故對(duì)樣品測(cè)定不產(chǎn)生干擾。

3.2 提取溶劑的選擇 柴胡皂苷a與d在酸性條件下容易向柴胡皂苷b1、b2轉(zhuǎn)化，而小柴胡顆粒制劑中有酸性成分，為避免在處理過程中導(dǎo)致柴胡皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化，參照藥典提取溶劑采用5%氨水的甲醇溶液作為提取溶劑。

表4 小柴胡顆粒中柴胡皂苷a與d含量測(cè)定結(jié)果

3.3 提取方式的選擇 有報(bào)道采用SPE固相萃取進(jìn)行皂苷類的提?。?］，為了除雜增加檢測(cè)靈敏度，而液質(zhì)聯(lián)用采用MRM模式，優(yōu)勢(shì)就是在復(fù)雜基質(zhì)條件下對(duì)于所測(cè)組分進(jìn)行準(zhǔn)確含量測(cè)定，故筆者采用超聲30 min，即可對(duì)柴胡皂苷提取完全

3.4 指標(biāo)成分的選擇 已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)柴胡成方制劑中柴胡皂苷b1與b2進(jìn)行含量測(cè)定［9-10］，但是作者分析柴胡皂苷b1與b2為柴胡皂苷a與d轉(zhuǎn)化而來，轉(zhuǎn)化過程中與制劑工藝及樣品穩(wěn)定性與包裝，存放環(huán)境等諸多因素相關(guān)，而對(duì)柴胡皂苷a與d的含量測(cè)定可以對(duì)小柴胡顆粒的整個(gè)制劑工藝以及包裝材料選擇與存放等進(jìn)行考察，故依舊選擇柴胡皂苷a與d作為其含量測(cè)定指標(biāo)性成分。

3.5 色譜條件的選擇 藥典柴胡項(xiàng)下對(duì)柴胡皂苷a與d的含量測(cè)定采用梯度洗脫，低紫外波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，目的是為了排除紫外干擾，對(duì)柴胡皂苷a與d進(jìn)行完全分離，而筆者采用液質(zhì)聯(lián)用，即使柴胡皂苷a與d不能完全分離也不影響其定量，故采用等度洗脫，增加方法的耐用性。

3.6 柴胡皂苷穩(wěn)定性探討 據(jù)文獻(xiàn)研究在酸性條件提?。?1］，SSa與SSd全部轉(zhuǎn)化。而常溫提取時(shí)，SSa轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b1，SSd轉(zhuǎn)化為b2;加熱時(shí)SSa與SSd發(fā)生糖苷鍵酸水解。在弱堿性條件下，SSa與SSd均比較穩(wěn)定;在中性常溫條件提取時(shí)，柴胡皂苷a、d比較穩(wěn)定，但以水作溶劑加熱時(shí)，SSd轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b2。而有研究表明［12］，使提取環(huán)境呈弱堿性可以抑制柴胡皂苷環(huán)氧醚鍵的斷裂，但是同時(shí)需控制堿性的強(qiáng)度，防止乙酰類柴胡皂苷脫去乙酰基，從而達(dá)到控制原型皂苷的目的。而在制劑工藝中采用水煎，復(fù)方中柴胡及黃芩等藥材均含有有機(jī)酸，而煎煮溫度及有機(jī)酸均會(huì)造成原生柴胡皂苷向次生皂苷的轉(zhuǎn)化。而利用液質(zhì)聯(lián)用的高靈敏度，控制原生皂苷SSa與SSd的含量，進(jìn)而控制制劑工藝及制劑穩(wěn)定性對(duì)于小柴胡顆粒成方制劑的質(zhì)量是合理的。

初期質(zhì)譜條件優(yōu)化時(shí)，在負(fù)模式情況下加響應(yīng)較正模式大，故采用乙酸銨作為流動(dòng)相添加劑，通過比較 Thermo Hypersil ODS，Merck Star，ZORBAX SB等品牌色譜柱，最終ZORBAX SB色譜柱分離效果最優(yōu)，故選擇ZORBAX SB作為分離色譜柱。

從檢測(cè)結(jié)果來看，市場(chǎng)中小柴胡顆粒的含量差異巨大，最高含量是最低含量的近10倍，分析原因可能與柴胡投料有關(guān)，近期由于柴胡價(jià)格飛漲，不良廠家可能為了減少原料成本，投料達(dá)到柴胡定性要求即可，而柴胡皂苷含量低的另外一個(gè)原因與成藥放置時(shí)間有關(guān)，建議廠家在產(chǎn)品上市后對(duì)小柴胡顆粒中的有效成分，特別是主要成分穩(wěn)定性進(jìn)行考察。建議增加藥典中小柴胡顆粒柴胡主要成分柴胡皂苷a與d的質(zhì)量控制，提高我國傳統(tǒng)中藥質(zhì)量。

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