小麥胚芽油抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥效學(xué)研究

成利娟，葛朝亮，楊 翠，劉 銘，許杜娟，

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科;3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，安徽合肥 230022)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種以動(dòng)脈內(nèi)膜有黃色粥樣脂質(zhì)積聚、血栓形成、纖維組織增生以及動(dòng)脈中層鈣化為特征的慢性進(jìn)行性疾病，主要累及大中型動(dòng)脈［1］。研究已證實(shí)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展。抗氧化成為AS治療的重要方式之一?！叭烊?，低價(jià)位”的追求趨勢(shì)使人們積極地發(fā)現(xiàn)并研究具有抗氧化活性的天然成分。小麥胚芽油(WGO)為禾本科植物小麥成熟種子的胚芽中提取的油酯，含有豐富的天然維生素E和亞油酸等多種人體必須的活性成分［2］。本實(shí)驗(yàn)組的前期研究表明，WGO能清除自由基，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的 酶比活力，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，具有良好的體內(nèi)外抗氧化活性。本研究在前期的基礎(chǔ)上觀察WGO對(duì)AS大鼠的治療效果，并進(jìn)一步探討其抗AS的作用機(jī)制，為其在心血管疾病的預(yù)防用藥及輔助治療的開發(fā)應(yīng)用方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠70只，體重(200±20)g，SPF級(jí)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(皖動(dòng)準(zhǔn)字號(hào)SCXK2011－002)。

1.2 藥品與試劑 小麥胚芽(安徽蒂王集團(tuán)食品有限公司提供);大鼠血清前列環(huán)素(PGI2)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司提供，CSBE13706r);血栓素A2(TXA2)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司提供，CSB-E12689r);內(nèi)皮素-1(ET-1)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司提供，CSB-E06979r);阿托伐他汀片(輝瑞制藥有限公司，批號(hào):1237209);VD注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):120812)。

1.3 儀器 CO2超臨界萃取裝置(杭州華黎泵業(yè)有限公司);GL20A全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠);UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);MK3型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾公司);XW-80A渦旋混合器;OLYMPUS BX51顯微鏡(日本OLYMPUS公司);RM 2125型切片機(jī)(德國LEICA公司)。

2 方法

2.1 高脂乳劑的制備 水相:全脂奶粉120 g，食用鹽8 g，丙二醇36 g，丙基硫氧嘧啶10 g，膽酸鈉10 g，蔗糖200 g，水280 g，加熱溶解制成水相;油相:豬油200 g，膽固醇100 g，吐溫 80 36 g，加熱溶解制成油相;水相加入油相攪拌相互溶解制成乳劑，冷卻，加入維生素 0.8 g，礦物質(zhì) 0.4 g，放入冰箱保存?zhèn)溆?，灌胃前加熱融化?/p>

2.2 動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型的制備［3］健康雄性SD大鼠70只，取10只健康雄性SD大鼠作為正常組給予等量生理鹽水。余下腹腔注射維生素D3(60 U·kg－1，分3 d注射)。其后開始灌胃給予高脂乳劑10 mL·kg－1，每日1次，建立AS大鼠模型。連續(xù)灌胃4周后，隨機(jī)選擇處理4只模型大鼠，觀察主動(dòng)脈弓內(nèi)膜—中層厚度等血管病理狀況，驗(yàn)證模型是否建立成功。

2.3 WGO的制備 將小麥胚芽顆粒過20目篩，去除細(xì)粉，稱重800 g。超臨界CO2萃取WGO，提取溫度為45℃，壓力為40 MPa，提取時(shí)間為180 min，CO2流量為15 kg·h－1，分離溫度為50℃，分離壓力為8 MPa。提取WGO 185 g，提取率為23.13%。提取出的WGO為亮黃色黏稠油狀液體，無特殊氣味，均勻，無沉淀。采用氣相色譜進(jìn)行質(zhì)量分析:儀器:Agilent 6890NGC13，色譜柱:ZB-1(30 m × 0.25 mm×0.25μm)，進(jìn)樣口溫度:300℃，檢測(cè)器溫度:300℃(FID)，柱溫:250℃，載氣:He，流速:2.4 mL·min－1，分流比:20∶1，進(jìn)樣體積:20 μL。檢測(cè)結(jié)果，提取的WGO中生育酚總含量達(dá)0.27%，其中α-生育酚相對(duì)含量達(dá)73.1%。

2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥［4］將造模后的56只的大鼠進(jìn)行分組，其中模型對(duì)照組10只，陽性藥物組(8 mg·kg－1)10 只，WGO 高(2.0 g·kg－1)、中(1.0 g·kg－1)、低劑量(0.5 g·kg－1)各 12 只。灌胃給予WGO 8周，每天1次。除去造模后不正常進(jìn)食及灌胃后損傷的大鼠，最終進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)的大鼠為WGO高劑量組7只、中劑量組7只、低劑量組7只，陽性藥物組7只，模型對(duì)照組7只，正常對(duì)照組6只(正常對(duì)照組給予相應(yīng)蒸餾水)。

2.5 標(biāo)本的采集 給藥8周清晨空腹，用3.5%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，分離主動(dòng)脈弓，縱行剪開，在10%中性福爾馬林溶液中固定。血樣低溫離心取血清。生理鹽水沖洗主動(dòng)脈弓上的殘血，取主動(dòng)脈弓縱切面，石蠟包埋。

2.6 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

2.6.1 ELISA 法測(cè)定血清中 PGI2、TXA2、ET-1 的含量 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.6.2 主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察 固定24 h后的大鼠主動(dòng)脈弓組織經(jīng)脫水后石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚度為3～4μm，每個(gè)組織連續(xù)切片15張，隨機(jī)取出3張，HE染色，鏡檢。

3 結(jié)果

3.1 WGO 對(duì) AS 大鼠血清中 PGI2、TXA2、ET-1含量的影響 與正常組相比，AS模型組大鼠血清中PGI2的含量顯著降低(P ＜0.01)，TXA2、ET-1的含量均顯著增加(P＜0.01)。AS大鼠連續(xù)WGO灌胃給藥8周后，高、中劑量組血清PGI2含量明顯增高(P ＜0.01，P ＜0.05)，TXA2、ET-1 含量均明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，低劑量組 PGI2、TXA2、ET-1含量則未見明顯改變(P＞0.05)。見圖1～3。模型組TXA2/PGI2比值高于正常組，WGO灌胃給藥8周后，該比值呈劑量依賴性降低。

3.2 WGO對(duì)AS大鼠主動(dòng)脈弓形態(tài)學(xué)的影響正常組(A)大鼠主動(dòng)脈弓形態(tài)正常，細(xì)胞層染色均勻，排列緊密而整齊。內(nèi)皮細(xì)胞完整，單層緊貼內(nèi)彈力板，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊，呈長橢圓形，外膜為疏松結(jié)締組織;模型組(B)大鼠主動(dòng)脈弓血管形態(tài)明顯改變，原有整齊層次分明的結(jié)構(gòu)已完全消失，管壁明顯增厚，內(nèi)膜層泡沫細(xì)胞可達(dá)五六層，平滑肌增生明顯，細(xì)胞排列紊亂，纖維組織增生伴片狀或點(diǎn)狀鈣化，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，形成纖維增生性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，斑塊表面纖維帽薄，突出的斑塊內(nèi)含有壞死物質(zhì)，平滑肌細(xì)胞減少，呈較典型的成熟動(dòng)脈粥樣硬化斑塊;WGO高劑量組(E)大鼠主動(dòng)脈弓血管形態(tài)基本完全趨于正常組(A)，細(xì)胞恢復(fù)正常層次，完整且排列緊密、均勻，中劑量組(D)與模型組(B)比較也有相應(yīng)的改善，動(dòng)脈粥樣斑塊已消失，細(xì)胞排列向著整齊均勻過渡，但仍有部分泡沫細(xì)胞;WGO低劑量組(C)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的主動(dòng)脈弓形態(tài)無明顯的改善作用(見圖4)。

4 討論

心腦血管疾病成為世界范圍內(nèi)威脅人類健康的主要原因，無論冠心病還是腦卒中，他們共同的病理基礎(chǔ)都是動(dòng)脈粥樣硬化。防治動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)預(yù)防心腦血管疾病有重要意義。尋求天然低毒的有效抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物是人們共同的目標(biāo)。有“液體黃金”之稱的WGO，富含亞油酸，又是天然維生素的優(yōu)良載體，具有極高的保健、治療價(jià)值。其藥用價(jià)值亟待研究與開發(fā)。

AS是一種慢性、進(jìn)行性、多發(fā)性血管內(nèi)膜疾病，對(duì)本病的發(fā)病機(jī)制，有多種學(xué)說從不同角度來闡述，包括氧化應(yīng)激學(xué)說、血栓形成學(xué)說、內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說等［5－6］?；钚匝鯀⑴c炎癥、脂質(zhì)過氧化、衰老等多種病理損傷，氧自由基增加胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度，減少一氧化氮(NO)的生成，使血管舒張作用減弱。同時(shí)，鈣離子內(nèi)流消耗三磷酸腺苷(ATP)，使ATP減少。NO和ATP共同減少導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損;過度的氧化應(yīng)激可促進(jìn)炎癥因子和黏附分子過表達(dá)進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞;同時(shí)還可通過氧化修飾的脂類引起AS的各種炎癥效應(yīng)［7］。因此抗氧化劑的應(yīng)用在治療AS中有重要意義，阻止低密度脂蛋白(LDL-C)氧化，改變高密度脂蛋白(HDL-C)的組成和活性，增加載脂蛋白的水平，有助于膽固醇的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)，使動(dòng)脈粥樣硬化病變減輕，被稱為具有應(yīng)用前景的藥物。本實(shí)驗(yàn)組的前期研究表明，WGO能清除自由基，提高 SOD、GSH-Px酶比活力，降低MDA含量，具有良好的體內(nèi)外抗氧化活性，有望成為新的治療AS的天然高效藥物。

生物體內(nèi)血栓形成過程中PGI2與TXA2是一對(duì)抗衡因子［8－10］。PGI2 可由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，是花生四烯酸連鎖反應(yīng)的最終產(chǎn)物，具有強(qiáng)力抗血小板凝集作用和血管擴(kuò)張作用，能調(diào)節(jié)血管張力，對(duì)維持各種組織血流起重要作用。由血小板產(chǎn)生的TXA2可促進(jìn)血小板聚集，血管收縮，促進(jìn)凝血及血栓形成。文獻(xiàn)報(bào)道及該實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)，動(dòng)脈硬化病理下的血管合成PGI2減少，TXA2 增多，TXA2/PGI2 比例顯著增高［11］。ET-1一種在心血管中起重要作用的內(nèi)源性長效血管收縮調(diào)節(jié)因子。內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激合成并釋放ET-1，與相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高，從而發(fā)揮其縮血管作用，是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)。目前大量研究表明嚴(yán)重心絞痛、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷的機(jī)體均伴有ET-1的過度表達(dá)［11］。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)AS模型大鼠ET-1明顯高于正常組，血管舒縮狀態(tài)嚴(yán)重失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷。

AS模型大鼠給予WGO后，TXA2/PGI2比值呈劑量依賴性降低，失衡狀態(tài)得到明顯改善，提示W(wǎng)GO可通過調(diào)節(jié)TXA2/PGI2平衡抑制血栓形成而防治AS。中、高劑量的WGO顯著降低TXA2、ET-1的含量，明顯提高PGI2，通過調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)平衡而修復(fù)損傷的內(nèi)皮。病理結(jié)果提示W(wǎng)GO可能參與調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖途徑，抑制泡沫細(xì)胞的形成等機(jī)制逆轉(zhuǎn)、改善動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［12－13］。

本實(shí)驗(yàn)表明WGO能明顯逆轉(zhuǎn)AS大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的防治起到重要作用。其作用機(jī)制可能涉及抗氧化、抑制血栓形成、保護(hù)血管內(nèi)皮等多方面。但目前對(duì)于WGO的研究尚集中在提取方法的研究，對(duì)其藥效學(xué)及作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。文中有關(guān)WGO治療AS的研究仍是初步的，更全面、完善的藥效及作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的探索和研究，為其在心血管疾病的預(yù)防用藥及輔助治療的開發(fā)應(yīng)用方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論參考。

［1］Palozza P，Parrone N，Simone RE，et al.Lycopene in atherosclerosis prevention:an integrated scheme of the potential mechanisms of action from cell culture studies［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2010，504(1):26 －33.

［2］孫光艷.小麥胚芽油提取方法的比較分析［J］.科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2012，1(2):10.

［3］Zhao LY，Huang W，Yuan QX，et al.Hypolipidaemic effects and mechanisms of the main component of Opuntia dillenii Haw.polysaccharides in high－fat emulsion－induced hyperlipidaemic rats［J］.Food Chemistry，2012，134(2):964 －971.

［4］Karabacak M，Kanbur M，Eraslan G，et al.The antioxidant effect of wheat germ oil on subchronic coumaphos exposure in mice［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2011，74(7):2119 －2125.

［5］Rashidi B，Mohammadi M，Mirzaei F，et al.Amlodipine treatment decreases plasma and carotid artery tissue levels of endothelin－1 in atherosclerotic rabbits［J］.Pathophysiology，2011，18(2):137－142.

［6］Van Diepen JA，Berbée JF，Havekes LM，et al.Interactions between inflammation and lipid metabolism:relevance for efficacy of anti－ inflammatory drugs in the treatment of atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2013，228(2):306 －315.

［7］Thomas DD，Ridnour LA，Isenberg JS，et al.The chemical biology of nitric oxide:implications in cellular signaling［J］.Free Radical Biology and Medicine，2008，45(1):18 －31.

［8］Siasos G，Tousoulis D，Tsigkou V，et al.Flavonoids in atherosclerosis:an overview of their mechanisms of action［J］.Current Medicinal Chemistry，2013，20(21):2641 －2660.

［9］Fang W，Wei J，Han D，et al.MC －002 exhibits positive effects against platelets aggregation and endothelial dysfunction through thromboxane A2 inhibition［J］.Thrombosis Research，2014，133(4):610－615.

［10］Xiao CY，Hara A，Yuhki K，et al.Roles of prostaglandin I2 and thromboxane A2 in cardiac ischemia－reperfusion injury A study using mice lacking their respective receptors［J］.Circulation，2001，104(18):2210 －2215.

［11］Ivey ME，Osman N，Little PJ.Endothelin －1 signalling in vascular smooth muscle:pathways controlling cellular functions associated with atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2008，199(2):237 －247.

［12］Mooney D，McCarthy C，Belton O.Effects of conjugated linoleic acid isomers on monocyte，macrophage and foam cell phenotype in atherosclerosis［J］.Prostaglandins ＆ Other Lipid Mediators，2012，98(3):56－62.

［13］Prim CR，Baroncini LA，Précoma LB，et al.Effects of linseed consumption for a short period of time on lipid profile and atherosclerotic lesions in rabbits fed a hypercholesterolaemicdiet［J］.British Journal of Nutrition，2012，107(5):660 －664.