熱射病大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能研究①

張進(jìn)進(jìn)，王恒，房效莉，周立冬，吳士文

熱射病大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能研究①

張進(jìn)進(jìn)1，王恒1，房效莉2，周立冬3，吳士文1

目的觀(guān)察熱射病對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法Sprague-Dawley大鼠60只，隨機(jī)分為熱射病組(n=44)、手術(shù)對(duì)照組(n=8)、正常對(duì)照組(n=8)。建立熱射病大鼠模型。造模7 d后行Morris水迷宮試驗(yàn)。前5 d記錄逃避潛伏期；第6天去除平臺(tái)，記錄大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)與在目標(biāo)象限的停留時(shí)間。結(jié)果熱射病組死亡16只。熱射病組大鼠逃避潛伏期較其他兩組延長(zhǎng)(P＜0.05)，目標(biāo)象限停留時(shí)間及經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05)。結(jié)論熱射病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退。

熱射?。籑orris水迷宮；學(xué)習(xí)記憶；認(rèn)知功能；大鼠

[本文著錄格式]張進(jìn)進(jìn)，王恒，房效莉，等.熱射病大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能研究[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(3):272-275.

CITED AS:Zhang JJ,Wang H,Fang XL,et al.Learning and memory function of rats after heat stroke[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):272-275.

熱射病(heat stroke,HS)是一種最為嚴(yán)重的中暑類(lèi)型，主要臨床表現(xiàn)為核心體溫(core temperature,Tc)增高達(dá)40℃以上，同時(shí)并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，如注意力不集中、記憶減退、共濟(jì)失調(diào)、譫妄、驚厥、昏迷等，重癥患者可出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其中認(rèn)知及小腦功能損害最為突出[1-2]。本研究建立熱射病大鼠模型，應(yīng)用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，體重280～300 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004。5只一籠飼養(yǎng)，室溫(25± 0.5)℃，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。適應(yīng)環(huán)境4 d。試驗(yàn)前應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)試剔除先天愚鈍的大鼠。

大鼠按體重大小編號(hào)1～60，使用隨機(jī)數(shù)字表分為正常對(duì)照組(n=8)、手術(shù)對(duì)照組(n=8)和模型組(n=44)。

1.2 試驗(yàn)儀器

PowerLab/4SP多通道生理記錄儀：澳大利亞ADInstruments公司。XMZ404電子溫度傳感器、動(dòng)脈壓力傳感器、Morris水迷宮跟蹤系統(tǒng)：北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.3 造模方法

3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。

正常對(duì)照組大鼠置于(22±0.5)℃，濕度25%的環(huán)境中，不做任何處理；蘇醒后飼養(yǎng)在(25±0.5)℃的飼養(yǎng)房?jī)?nèi)，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。

手術(shù)對(duì)照組大鼠行股動(dòng)脈插管，監(jiān)測(cè)心電及動(dòng)脈壓，置于(22±0.5)℃，濕度25%的環(huán)境中，維持核心體溫(34±1)℃。蘇醒后放入單獨(dú)籠中，飼養(yǎng)在(25± 0.5)℃飼養(yǎng)房?jī)?nèi)，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。

模型組行股動(dòng)脈插管，監(jiān)測(cè)心電、動(dòng)脈壓及直腸溫度，置于溫、濕度控制箱中，熱暴露條件為(39.5± 0.2)℃，濕度13.5%，加熱燈光開(kāi)關(guān)時(shí)間比為15 s/30 s，發(fā)生熱射病(熱應(yīng)激后約120～150 min，大鼠核心體溫＞42℃或平均動(dòng)脈壓降至50 mmHg左右)后迅速予4℃涼水沖洗10 min。蘇醒后放入單獨(dú)籠中，飼養(yǎng)在(25±0.5)℃的飼養(yǎng)房?jī)?nèi)，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。

1.4 一般狀態(tài)觀(guān)察

造模后密切觀(guān)察各組大鼠死亡情況、精神狀態(tài)、進(jìn)食狀況、活動(dòng)步態(tài)狀況及抽搐等。

1.5 Morris水迷宮測(cè)試

造模7 d后行Morris水迷宮測(cè)試。

1.5.1 定位航行試驗(yàn)(place navigation)

實(shí)驗(yàn)前1 d，將大鼠放入水池中(不放平臺(tái))自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每天訓(xùn)練4次，訓(xùn)練時(shí)間為每天9:00～17:00。從池壁4個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水池，錄像記錄系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)和游泳路徑。如果大鼠在120 s內(nèi)找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái)，在平臺(tái)上休息10 s，潛伏期記為120 s。每次訓(xùn)練間隔至少1 h。每天4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為大鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī)。

1.5.2 空間探索試驗(yàn)(spatial probe)

第6天撤除平臺(tái)，將大鼠任選1個(gè)入水點(diǎn)放入水中，所有大鼠為同一入水點(diǎn)，記錄大鼠120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)及在目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。服從或近似正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用組間兩兩比較Games-Howell方法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

44只模型組大鼠在(152.370±24.21)min發(fā)生熱射病，即刻平均動(dòng)脈壓迅速下降，幾乎所有大鼠在核心體溫達(dá)40℃以上，鼻中流出大量水樣分泌物。大多數(shù)大鼠在發(fā)生熱射病時(shí)均有抽搐。2只在發(fā)生熱射病后不久腹瀉，隨后死亡。共死亡16只，均發(fā)生在造模后24 h內(nèi)，成活率53.6%。

模型組大鼠蘇醒后出現(xiàn)飲食減少、倦怠少動(dòng)、精神萎靡、毛發(fā)混亂、嗜睡、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)緩慢、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀，7 d后癥狀好轉(zhuǎn)，反應(yīng)較正常組對(duì)照組及手術(shù)對(duì)照組稍慢、較溫順。正常組及手術(shù)對(duì)照組大鼠未見(jiàn)明顯行為學(xué)異常。

2.2 Morris水迷宮測(cè)試

初篩試驗(yàn)第5天測(cè)試結(jié)果用0 d表示。造模結(jié)束7 d后再次水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)5 d，記為1～5 d。0～3 d時(shí)，三組定位航行逃避潛伏期無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；4～5 d時(shí)，模型組逃避潛伏期較正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組延長(zhǎng)(P＜0.05)，正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

空間探索試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M目標(biāo)象限停留時(shí)間及經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)較正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組減少(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組治療前后Morris水迷宮測(cè)試逃避潛伏期比較(s)

表2 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試空間探索比較

3 討論

中暑是在高溫天氣、濕度大、無(wú)風(fēng)環(huán)境下出現(xiàn)的體溫調(diào)節(jié)中樞功能障礙，以無(wú)汗、水電解質(zhì)過(guò)多喪失為特征的疾病[3]。中暑的嚴(yán)重階段即稱(chēng)之為熱射病[4]。熱射病是由于過(guò)高的溫度造成的急性機(jī)體損傷，可導(dǎo)致個(gè)體死亡，且死亡率特別高。

高熱可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，依據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀發(fā)生的時(shí)間順序，可分為3個(gè)階段：急性期、恢復(fù)期以及永久性損害。急性期主要表現(xiàn)為精神異常、抽搐及意識(shí)障礙[5]；恢復(fù)期主要表現(xiàn)為短暫的神經(jīng)功能不全，包括注意力不集中、記憶減退、意識(shí)錯(cuò)亂、躁動(dòng)、攻擊性、視覺(jué)受損、行為不當(dāng)、定向力障礙及小腦體征等癥狀[6]；而永久性損害最主要的表現(xiàn)是認(rèn)知損傷與小腦體征[7-8]。文獻(xiàn)報(bào)道，20%～30%熱射病幸存者遺留永久性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[9]。熱射病后出現(xiàn)精神和認(rèn)知方面的改變的發(fā)病機(jī)制目前仍不明了。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，熱射病后存在一過(guò)性或長(zhǎng)期認(rèn)知功能后遺癥狀，輕者表現(xiàn)為記憶力下降、注意力不集中，重者表現(xiàn)為全面癡呆[10-11]。

根據(jù)動(dòng)物熱射病診斷標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)，當(dāng)高溫應(yīng)激動(dòng)物核心溫度達(dá)到42.0℃以上，或動(dòng)脈收縮壓上升到達(dá)峰值后下降到50 mmHg時(shí)，為發(fā)生重度熱射病的標(biāo)志[12]。本研究以平均動(dòng)脈壓從峰值下降到50 mmHg左右為標(biāo)準(zhǔn)建立大鼠熱射病模型，輔以監(jiān)測(cè)大鼠肛溫。造模成功大鼠行為觀(guān)察符合熱射病表現(xiàn)，正常組及假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)明顯行為學(xué)異常。

Morris水迷宮測(cè)試是用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能力評(píng)估的重要工具，由英國(guó)生理學(xué)Richard G.Morris設(shè)計(jì)并首次使用，最常采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是大鼠與小鼠[13]。定位航行實(shí)驗(yàn)又叫隱匿平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，受試動(dòng)物在多次的訓(xùn)練中，學(xué)會(huì)尋找固定位置的隱蔽平臺(tái)，以異我為參照點(diǎn)，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知，所形成的記憶是一種空間參考記憶，用于動(dòng)物空間學(xué)習(xí)能力的檢測(cè)；空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)動(dòng)物空間記憶能力[14]。

本研究顯示，造模前各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力差別不大。造模7 d后，模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。

熱射病常見(jiàn)的受損的部位包括大腦皮層、海馬、邊緣系統(tǒng)、小腦、腦干、脊髓等[15]。McLaughlin等發(fā)現(xiàn)，熱射病患者M(jìn)RI檢查示雙側(cè)內(nèi)囊、殼核和小腦均有疑似出血灶，指出這些細(xì)小靜脈血栓常出現(xiàn)在亞急性期，是遲緩性腦萎縮的前驅(qū)表現(xiàn)[16]。Mahajan等報(bào)道1例非洲裔54歲男性熱射病患者，入院后9 d MRI檢查顯示雙側(cè)海馬區(qū)、皮質(zhì)下白質(zhì)異常，雙側(cè)小腦及尾狀核均勻增強(qiáng)[17]。前期我們對(duì)熱射病大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，熱射病對(duì)海馬及小腦造成一定病理?yè)p害。

高熱導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)及小腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、壞死，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞內(nèi)尼氏體減少或消失，細(xì)胞形態(tài)皺縮，嚴(yán)重者還出現(xiàn)海馬及小腦的缺血壞死，這些改變主要位于海馬CA3、CA4、CA1區(qū)域[18]。Lee等發(fā)現(xiàn)，熱射病后小腦損傷及癥狀的產(chǎn)生可能由于小腦Purkinje細(xì)胞對(duì)熱損傷尤其敏感，Purkinje細(xì)胞嚴(yán)重丟失[15]。Fushimi等也證實(shí)小腦傳出通路通常受損[19]。

熱射病后腦損害機(jī)制有多種學(xué)說(shuō)，其中腦缺血、缺氧是熱射病后腦損傷的主要病理生理基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短暫的腦缺血可導(dǎo)致對(duì)缺血特別敏感的神經(jīng)元受損，缺血后2～4 d可出現(xiàn)廣泛的神經(jīng)元壞死和脫失；易損的神經(jīng)元主要分布在海馬、紋狀體和大腦皮質(zhì)[20-21]。

海馬是參與學(xué)習(xí)記憶功能最重要的腦區(qū)之一，由相互聯(lián)系的CA1、CA3和齒狀回等多個(gè)區(qū)域組成。海馬的損傷可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。近年來(lái)，隨著影像學(xué)、神經(jīng)電生理學(xué)、解剖學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，證實(shí)小腦也參與了非運(yùn)動(dòng)的高級(jí)認(rèn)知功能，小腦某些區(qū)域損害，可引起高級(jí)認(rèn)知功能障礙，如記憶力減退、注意力不集中、推理能力減退、語(yǔ)言障礙等[22]。已經(jīng)證實(shí)熱射病后有小腦損害，推測(cè)小腦損傷可能也參與熱射病后認(rèn)知功能損害，有待進(jìn)一步研究。

熱射病在軍隊(duì)中更常見(jiàn)，特別是在高溫下訓(xùn)練作戰(zhàn)的戰(zhàn)士。由于這種熱損傷都是急性發(fā)作，受損傷者通常只需要休息一段時(shí)間，又返回訓(xùn)練。過(guò)去對(duì)熱射病的研究缺少大量的隨訪(fǎng)和對(duì)認(rèn)知功能的評(píng)定，可能忽略了許多認(rèn)知方面的改變。本研究提示，應(yīng)該高度重視及隨訪(fǎng)熱射病患者的認(rèn)知功能。

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Learning and Memory Function of Rats after Heat Stroke

ZHANG Jin-jin1,WANG Heng1,FANG Xiao-li2,ZHOU Li-dong3,WU Shi-wen1
1.The Clinical College of the General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces,Anhui Medical University,Beijing 100039,China;2.Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu 221000,China;3.Medical Experimental Center of the General Hospital of Chinese People'sArmed Police Forces,Beijing 100039,China

Objective To observe the learning and memory function of rats after heat stroke.Methods 60 Sprague-Dawley rats were divided randomly into heat stroke group(n=44),sham group(n=8)and control group(n=8).They were tested with the Morris Water Maze 7 days after modeling.The escaping latency was recorded in the first 5 days,and it was recorded with frequency crossing the platform area and the duration in the target quadrant after ridding the platform on the 6th day.Results 16 rats died in the heat stroke group after modeling. The escaping latency increased(P＜0.05),and the cumulative duration in the target quadrant and the frequency of crossing the previous platform decreased(P＜0.05)in the heat stroke group compared with the other groups.Conclusion The learning and memory ability is impaired after heat stroke in rats.

heat stroke;Morris Water Maze;learning and memory;cognitive function;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.007

R594.1

A

1006-9771(2015)03-0272-04

2014-11-26

2015-01-06)

國(guó)家發(fā)改委衛(wèi)星專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目(No.發(fā)改辦高技[2013]2140)。

1.安徽醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院臨床學(xué)院，北京市100039；2.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州市221000；3.武警總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京市100039。作者簡(jiǎn)介：張進(jìn)進(jìn)(1989-)，女，漢族，安徽合肥市人，碩士研究生，主要研究方向：熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷研究。通訊作者：吳士文，男，博士，副教授、碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:nuerowu@gmail.com。