CDK8、KAI1蛋白在宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變中表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

熊 娟

(湖北省黃石市中醫(yī)醫(yī)院婦科，湖北黃石 435000)

宮頸癌是三大婦科惡性腫瘤之一，死亡率排名第二，僅次于乳腺癌［1］。宮頸癌特點(diǎn)具有侵襲能力強(qiáng)、惡性程度高、早期可由淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的特點(diǎn)。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，經(jīng)歷宮頸不典型增生、原位癌、微小浸潤(rùn)癌、浸潤(rùn)癌等動(dòng)態(tài)演進(jìn)過程。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展與基因異常表達(dá)、癌基因激活、DNA損傷修復(fù)、DNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)失控、抑癌基因失活等相關(guān)，最根本的表現(xiàn)為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂［2］。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白失調(diào)可作為導(dǎo)致腫瘤的原因之一［3］。惡性腫瘤擁有侵襲和轉(zhuǎn)移的最重要的生物學(xué)特征，侵襲和轉(zhuǎn)移中藥的環(huán)節(jié)之一就是黏附力降低或者喪失，侵襲、轉(zhuǎn)移與預(yù)后密切相關(guān)，組織分型、臨床分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移等因素可反應(yīng)宮頸癌惡性程度及預(yù)后［4］。本文采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CDK8與KAI1的表達(dá)情況，分析兩組因子與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2010年2月—2014年4月黃石市中醫(yī)醫(yī)院保存的石蠟組織標(biāo)本，宮頸癌組織36例，其中宮頸腺癌17例，鱗癌19例。根據(jù)2000年FIGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期15例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例;按病理分化程度，Ⅰ級(jí)17例，Ⅱ級(jí)11例，Ⅲ級(jí)8例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例;宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(CIN)110例，其中宮頸低度病變組(CINⅠ50例)，宮頸高度病變組(CINⅡ30例、CINⅢ30例);正常宮頸組織20例。患者年齡29～68歲，中位年齡50歲，患者均未經(jīng)過放化療等特殊方式治療。標(biāo)本處理:經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋標(biāo)本，以5 μm厚度切片代用。對(duì)36例宮頸癌患者進(jìn)行1～4年的隨訪，統(tǒng)計(jì)不同分組的死亡率。

1.2 儀器與試劑 免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色液均由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供，CDK8、KAI1綿羊抗人多克隆抗體由 R＆D公司提供，CDK8、KAI1鼠抗人單克隆抗體工作液由福建邁新生物技術(shù)有限公司提供，已知的CDK8、KAI1陽性對(duì)照染色片。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 (1)CDK8蛋白的檢測(cè):采用免疫組織化學(xué)染色法，采用二甲苯脫蠟及梯度酒精水化處理切片后，加入少量3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化酶活性，加入一定量的枸櫞酸鈉(濃度:0.01 mol·L－1，pH6.0，100℃)修復(fù)抗原 10 min 后，用 PBS 沖洗4遍，在10%BSA的環(huán)境中封閉非特異性位點(diǎn)10 min。再加入鼠抗人CDK8單克隆抗體于4℃孵育過夜，然后用PBS沖洗3遍，加入CDK8綿羊抗人多克隆抗體于20℃孵育1 h，用PBS沖洗5遍，最后進(jìn)行DAB顯色觀察。(2)KAI1蛋白的檢測(cè):采用免疫組織化學(xué)染色法，操作方法同上，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.4 結(jié)果判定 CDK8、KAI1結(jié)果判定:于400倍光鏡下觀察，隨機(jī)選取正常宮頸組織切片、CIN組織切片、宮頸癌切片上5個(gè)視野，運(yùn)用奧林巴斯顯微鏡拍下視野圖像，使用IPP6.0軟件處理，將圖像灰度值轉(zhuǎn)換成吸光度值，計(jì)算出平均吸光度值(OD)=累積吸光度/面積。陽性對(duì)照采用已知的陽性對(duì)照染色片，陰性對(duì)照采用PBS代替鼠抗人CDK8、KAI1單克隆抗體為對(duì)照。KAI1陽性表達(dá)為在細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒。

2 結(jié)果

2.1 CDK8在宮頸癌及 CIN組織中的表達(dá)CDK8在組織細(xì)胞內(nèi)陽性表達(dá)，細(xì)胞核顯示為棕黃色。正常宮頸組織中幾乎沒有陽性細(xì)胞(圖1a);CINⅢ組織細(xì)胞中表達(dá)，陽性細(xì)胞較正常宮頸明顯增加(圖1b);宮頸腺、鱗癌組織陽性細(xì)胞棕黃色較深，細(xì)胞核增大異型(圖1c);CDK8在各組間表達(dá)，宮頸低度病變組顯著強(qiáng)于正常宮頸組(P＜0.05)，宮頸高度病變組顯著強(qiáng)于宮頸低度病變組(P＜0.05)，宮頸癌組顯著強(qiáng)于宮頸高度病變組(P＜0.05)，見表1。

2.2 CDK8表達(dá)與宮頸癌臨床特征的關(guān)系及預(yù)后單因素分析結(jié)果顯示，CDK8早宮頸癌組織表達(dá)與年齡、宮頸癌組織分型、臨床分期、細(xì)胞分化程度相關(guān)因素?zé)o關(guān)(P＞0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表2。對(duì)36例患者進(jìn)行隨訪結(jié)果，臨床分期Ⅰ期死亡2例，死亡率13.33%;Ⅱ期死亡3個(gè)，死亡率 20.08%;Ⅲ期死亡 3例，死亡率 37.50%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組死亡7例，死亡率46.67%;淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組死亡4例，死亡率19.05%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組死亡率顯著高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。

2.3 KAI1在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中的表達(dá)及預(yù)后 正常宮頸組織KAI1可明顯觀察到棕黃色陽性細(xì)胞的存在，隨著病情的發(fā)展，棕黃色陽性細(xì)胞逐漸減少。見圖2A～E。KAI1蛋白在正常宮頸組織、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組織、宮頸癌組織的陽性表達(dá)率分別為100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1 在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ組織的表達(dá)顯著強(qiáng)于在宮頸癌組織(P＜0.05)，在正常宮頸組織、CINⅠ的表達(dá)顯著強(qiáng)于在CINⅢ(P＜0.05)，在正常宮頸組織表達(dá)顯著強(qiáng)于在CINⅡ(P ＜0.05)。見表3。

表1 CDK8在各組織表達(dá)的平均吸光度比較

表2 CDK與宮頸癌臨床特征關(guān)系單因素分析結(jié)果

表3 KAI1在各組織中陽性表達(dá)率

2.4 KAI1表達(dá)與宮頸癌臨床特征的關(guān)系及預(yù)后KAI1在宮頸癌組織中的表達(dá)均與年齡、組織分型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)。見表4。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展與基因異常表達(dá)、癌基因激活DNA損傷修復(fù)、DNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)失控、抑癌基因失活等相關(guān)，最根本的表現(xiàn)為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂［5］。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白失調(diào)可作為導(dǎo)致腫瘤的原因之一［6－7］。主要的細(xì)胞周期調(diào)控分組有3大類:細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)、細(xì)胞周期蛋白(cyckins)、CDK抑制物(CKI)，它們之間相互作用進(jìn)行精細(xì)與復(fù)雜的細(xì)胞周期調(diào)控。CDK是關(guān)鍵調(diào)控因子，能啟動(dòng)DNA合成、促進(jìn)細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)變、調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，CDK活血受到cyslins正調(diào)控和CKIs負(fù)調(diào)控影響。CDK的活性異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系［8］。

表4 KAI1表達(dá)與宮頸癌臨床特征的單因素分析

CDK8屬于CDK家族一員，分子量為53～55 Ka，位于基因的13q12、13 段，能與 MED12、MED13、cyclinC結(jié)合組成四聚體調(diào)控復(fù)合物，MED12、cyclinC負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)CDK8活性，MED13負(fù)責(zé)聚集CDK8到四聚體調(diào)控復(fù)合體。人體CDK8還有一種Ser酶，其能調(diào)節(jié)與 cyclins、CKI結(jié)合［9］?，F(xiàn)代研究對(duì)CKD8具體致癌機(jī)制尚未明了，有相關(guān)研究表明，CDK8能正向調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ，間接抑制β-catenin的表達(dá)，增加P53轉(zhuǎn)錄中得協(xié)同激活作用，正向調(diào)節(jié)EGR轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成等。目前研究表明CDK8異常表達(dá)對(duì)大腸癌、胃癌、惡性黑色素瘤的發(fā)生有重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，βcatenin、EGR轉(zhuǎn)錄因子、P53的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，CDK8能正向調(diào)節(jié)EGR轉(zhuǎn)錄因子、P53的表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié) β-catenin的表達(dá)。KAI1蛋白屬于四次跨膜超家族成員，分子量為29 610 Ka，長(zhǎng)2.4 Kb，由267個(gè)氨基酸編碼組成，其結(jié)構(gòu)是細(xì)胞膜糖蛋白，主要分布在哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞及白細(xì)胞表面［10］。KAI1蛋白擁有一個(gè)大的細(xì)胞外親水結(jié)構(gòu)區(qū)和4各高度保守的疏水結(jié)構(gòu)區(qū)。KAI1主要參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用及細(xì)胞的增殖活動(dòng)［11］。KAI1蛋白能抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，對(duì)細(xì)胞活動(dòng)、黏附能力、轉(zhuǎn)移增生有影響，并通過胞內(nèi)信號(hào)通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)。通過Qac GT Pase和Src激酶抑制腫瘤細(xì)胞增殖，激活T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［12－13］。KAI1可在前列腺癌表達(dá)，也可在多種腫瘤(如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌)組織或者轉(zhuǎn)移病灶中表達(dá)，隨著病情的惡化，KAI1的表達(dá)呈下降或消失趨勢(shì)［14－15］。KAI1表達(dá)下降或者消失，可在不影響原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的條件下，促進(jìn)轉(zhuǎn)移瘤形成。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDK8與患者的生存率和預(yù)后有直接關(guān)系，KAI1蛋白尚未發(fā)現(xiàn)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)。兩者之間并未存在直接關(guān)聯(lián)，兩者均可在組織或病灶中表達(dá)。

DK8在正常組織、CIN低度病變組織、CIN高度病變組織、宮頸癌組織中的表達(dá)呈顯著遞增的趨勢(shì)(P＜0.05)，CDK8在宮頸癌組織的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，36例宮頸癌患者隨訪后，臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期死亡率分別為 13.33%、20.08%、37.50%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移死亡率(46.67%)顯著大于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移(19.05%)，且有顯著性差異(P ＜0.05)，隨著病情的加重，CDK8表達(dá)增強(qiáng)，死亡率增大，說明CDK8的表達(dá)與患者的生存率和預(yù)后有直接關(guān)系;KAI1蛋白在正常宮頸組織、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組織、宮頸癌組織的陽性表達(dá)率分別為 100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1在宮頸癌組織中的表達(dá)均與年齡、組織分型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05);結(jié)果提示，KAI1蛋白表達(dá)可能與宮頸癌預(yù)后沒有關(guān)系，不能成為宮頸癌預(yù)后的一個(gè)有效指標(biāo)。綜上所述，CDK8與患者的生存率和預(yù)后有直接關(guān)系，可作為宮頸癌預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)，而KAI1蛋白尚未發(fā)現(xiàn)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)，需后續(xù)研究確認(rèn)，為臨床提供了理論依據(jù)。

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