百蕊草藥材高效液相特征圖譜的研究

王雨艨，張亞中，吳德玲

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031;2.安徽省毫州市食品藥品檢驗所，安徽毫州 236800;3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051)

百蕊草(Thesium Chinense Turcz)別名有百乳草、珍珠草、白風(fēng)草、一棵松、細須草、地石榴等，是檀香科百蕊草屬多種植物藥材的統(tǒng)稱。百蕊草是百蕊草或者其變種長梗百蕊草的干燥全草［1－5］，始載于《圖經(jīng)本草》，性寒而平緩，味微苦澀，具清熱解毒、通順氣脈、補腎澀精及調(diào)氣功效，有“植物抗生素”美稱。百蕊草常用于治療急性乳腺炎、急性扁桃體炎、上呼吸道感染、遺精、肺炎、咽炎、淋證、肺膿腫、淋巴結(jié)結(jié)核、乳蛾、乳癰、疔腫、黃疸以及腎虛腰痛、腎虛頭暈、各種感染等疾病，且無毒副作用［6］?！吨袊幍洹?977年版曾把百蕊草藥材收錄到其中，但僅從藥材性狀上進行控制，在使用過程中往往是原藥材或粗提入藥有效成分含量低，由于沒有一個統(tǒng)一的系統(tǒng)的質(zhì)量標準，缺乏相應(yīng)的評價體系，從而影響了這一傳統(tǒng)中草藥治療作用的發(fā)揮。因此，筆者選擇百蕊草素I作為指標性成分并對其特征圖譜進行研究，進而為百蕊草藥材質(zhì)量標準的制定提供科學(xué)依據(jù)［7－8］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLC高效液相色譜儀:沃特斯公司;色譜工作站:Masslynx工作站:沃特斯公司 ;色譜柱:Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);FA314 型電子天平(上海海康電子儀器廠)。指紋圖分析軟件:中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)。

1.2 試劑與試藥 乙腈為色譜試劑，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。對照品:百蕊草素Ⅰ(購自成都曼思特生物科技有限公司，批號:MUST－13112210含量為99.45%)。百蕊草藥材:共收集安徽、河南、湖北三省10批百蕊草藥材，均是以白茅為寄主，野生的百蕊草，并對其進行了鑒定，均為檀香科植物百蕊草(Thesium Chinense Turcz.)。見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，以乙腈(A)—0.2%甲酸(B)為流動相，按表(2)進行梯度洗脫，檢測波長為265 nm，柱溫35℃，流速 0.4 mL·min－1，進樣體積 2.0 μL，見表2。

表2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取百蕊草素Ⅰ對照品11.81 mg置20 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度，即可。

2.2.2 供試品溶液制備 取百蕊草藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀［9－10］。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，分別按“2.1”項下的方法測定供試品中各色譜峰的保留時間，其相對標準偏差RSD均小于1.0%，實驗表明:本法重現(xiàn)性良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6份，分別按2.1項下的方法測定供試品中各色譜峰的保留時間，其RSD均小于1.0%，實驗表明:本法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取新制備的供試品溶液，立即注入液相色譜儀，并每隔一定時間測定一次峰面積，直至45 h。其相對保留時間的相對標準偏差RSD均小于1%，峰面積在45 h內(nèi)的RSD均小于1.0%。實驗表明:本法重復(fù)性良好。

2.4 樣品測量結(jié)果 見表3。

表3 10批樣品色譜峰相對保留時間(min)

2.5 特征圖譜的建立 取收集到的10批百蕊藥材，分別按上述供試品溶液制備方法制成供試品溶液，再取百蕊草素Ⅰ對照品溶液，注入液相色譜儀測定，10批百蕊草藥材測定所得色譜圖，輸入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A中，分析處理，共12個共有峰，選擇其中4個作為特征峰。與參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±8%之內(nèi)。相對保留時間規(guī)定值為:0.52(峰 1)、1.00(峰 S)、1.18(峰2)、2.09(峰3)，見圖1、2。

3 討論

3.1 波長的選擇 文獻報道其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，因此現(xiàn)有的百蕊草質(zhì)量標準以測定百蕊草總黃酮的含量來控制藥材以及制劑的內(nèi)在質(zhì)量。通過文獻研究以及我們的實驗表明，黃酮類類化合物有兩個吸收峰，分別位于265 nm以及347 nm附件，因此吸收波長的選擇上，265 nm和347 nm均可，考慮到265 nm吸光度更強，取265 nm作為指紋圖的采集波長(圖3)。

3.2 流動相的選擇 文獻記載一般采用甲醇—磷酸系統(tǒng)，考慮到特征圖譜HPLC分離系統(tǒng)兼容LCMS特征圖譜輔助定性分析，極性流動相部分，采用了甲酸水系統(tǒng)。

3.3 樣品處理方法的選擇 首先對提取溶劑的種類(100%甲醇、60%甲醇30%甲醇)，其次是提取方法(超聲提取和加熱回流)，最后是提取時間(15、30、45 min)對色譜圖的影響。最后確定最佳樣品處理方法為取百蕊草藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液，即得。

4 結(jié)論

本文以百蕊草藥材為研究對象，以百蕊草素I為對照品作為百蕊草中測定總黃酮的含量指標，對安徽、河南和湖北等三個產(chǎn)地10批的百蕊草藥材進行研究，建立了百蕊草藥材的HPLC特征圖譜，為百蕊草藥材質(zhì)量控制提供了有效的分析方法。同時對其主要有效成分百蕊草素Ⅰ進行了含量測定，為中藥制劑的質(zhì)量控制提供了良好的分析方法。為未來合理、有效地利用百蕊草資源提供了科學(xué)依據(jù)，同時也可用于制藥企業(yè)以及藥品監(jiān)管部門對百蕊草藥材的質(zhì)量控制及評價。

［1］羅夫來，郭巧生，王長林，等.百蕊草生物學(xué)特性研究［J］.中國中藥雜志，2012，37(2):176 －180.

［2］郭巧生，羅夫來.百蕊草群落物種多樣性與寄主調(diào)查研究［J］.中國中藥雜志，2011，36(3):268.

［3］路 鋒，趙穩(wěn)操，賈艷星，等.百蕊草屬藥學(xué)研究概況［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(31):19091 －19092.

［4］羅夫來，郭巧生，王長林，等.寄主對半寄生植物百蕊草影響的綜合評價研究［J］.中國中藥雜志2012，37(7):1174 －1179.

［5］羅夫來，郭巧生.百蕊草藥材內(nèi)在品質(zhì)研究［J］.中國中藥雜志，2011，36(15):2042 －2046.

［6］宣偉東，唐大海，卞 俊，等.百蕊草對阿奇霉素腎病大鼠治療作用的實驗研究［J］.藥學(xué)實踐雜志，2012，30(6):443 －446.

［7］李永紅.HPLC測定百蕊顆粒中山萘素的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(13):97 －99.

［8］湯 超，許伏新，徐國兵，等.百蕊草藥材的指紋圖譜研究［J］.中成藥，2011，33(7):1102 －1105.

［9］儲曉琴，岳 磊，胡葉青，等.正交設(shè)計優(yōu)選百蕊草的提取工藝［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，32(2):80 －82.

［10］儲曉琴，胡葉青，岳 磊.大孔吸附樹脂純化百蕊草總黃酮工藝研究［J］.中藥材，2013，36(3):478 －481.