反相高效液相色譜法測定血液中去甲萬古霉素濃度的研究

李順煒，袁孔現(xiàn)，朱 虹，詹三華

(銅陵市人民醫(yī)院藥劑科，安徽銅陵 244000)

反相高效液相色譜法(reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)是由非極性固定相和極性流動(dòng)相組成的液相色譜體系［1］，十八烷基鍵合硅膠為典型固定相，甲醇和乙腈則為典型流動(dòng)相。RP-HPLC作為液相色譜的主要分離模式，幾乎可分離測定所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物。

去甲萬古霉素(Norvancomycin)為糖肽類抗感染藥物，為快效殺菌劑，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁糖肽聚合物的合成，進(jìn)而妨礙細(xì)胞壁的形成。臨床上主要用于重癥感染患者的治療，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌等有較強(qiáng)的抗菌作用［2］。由于其抗感染治療作用顯著，存在不合理使用的可能，需要加強(qiáng)對該類藥物的使用監(jiān)管［3］。因其具有明確的耳、腎毒性［4］，使用時(shí)除需嚴(yán)格控制適應(yīng)證外，用藥劑量亦需個(gè)體化設(shè)計(jì)［5］，有條件的要進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測(TDM)。本文通過查閱文獻(xiàn)［6－8］，并根據(jù)現(xiàn)有條件，建立了一種快速測定去甲萬古霉素血藥濃度的方法，血液取樣量少，操作簡單、快速，靈敏度和準(zhǔn)確度較高，適用于臨床進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測和個(gè)體化給藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AD系列高效液相色譜儀，包括LC-20AD輸液泵、SPD-20AV型 UV/VIS檢測器，CTO-20A型柱溫箱、LC solution色譜工作站和CBM-20Alite系統(tǒng)控制器(日本島津制作所)。SIGMA高速離心機(jī)和MDF-382E超低溫冰箱(日本三洋電機(jī)生物醫(yī)學(xué)有限公司)。

1.2 試藥 去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號130338－200303)，替硝唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所，批號100336－200402)、甲硝唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所，批號0191－9804)。甲醇(色譜純，美國 Tedia公司，批號001916)、乙腈(色譜純，美國 Tedia公司，批號1108469)。特級新生牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司，批號20100310)。高氯酸、磷酸、磷酸二氫鉀、尿素為分析純。純化水為本實(shí)驗(yàn)室自制亞沸蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜分析使用Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相組成為甲醇—乙腈—40 mmol·L－1KH2PO4緩沖液(含 0.1% 磷酸)=15∶5∶80(v/v)，進(jìn)樣量為 20 μL，流速為 1.0 mL·min－1，柱溫35℃，紫外檢測波長236 nm。靈敏度AUFs=0.02，以峰面積、內(nèi)標(biāo)法定量。

2.2 流動(dòng)相和過渡相的配制 精密稱取KH2PO4(分析純)5.44 g，加入1 000 mL 純化水、1.0 mL 磷酸混勻，配制成40 mmol·L－1KH2PO4溶液。取800 mL KH2PO4溶液，與150 mL甲醇(色譜純)、50 mL乙腈(色譜純)混勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，脫氣5 min，即配制成流動(dòng)相。過渡相使用甲醇－純化水(20∶80，v/v)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、沉淀劑及助溶劑的配制 將去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品和替硝唑標(biāo)準(zhǔn)品置于105℃烘箱中干燥2 h。精密稱取100.0 mg去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，以2%尿素溶液定容至100 mL并搖勻，配制成1 000.0 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密稱取 20.0 mg替硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，以純化水定容至100 mL搖勻，配制成200 mg·L－1內(nèi)標(biāo)液。取15 mL高氯酸加純化水至100 mL，配制成15%高氯酸溶液作為沉淀劑。稱取20 g尿素加純化水至100 mL，配制成20%尿素溶液作為助溶劑。以上所有配制溶液均放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血樣處理 取血清200μL，加入內(nèi)標(biāo)液20μL后渦旋混勻，再加入20%尿素溶液和沉淀劑各100 μL，渦旋混勻1 min后，經(jīng)14 800 rpm高速離心8 min，取上清液20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用2%尿素溶液分別稀釋成濃度為20.0、40.0、80.0、160.0、320.0、640.0 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。取新生牛血清200μL置于離心管中，分別加入上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各50μL，混勻，使其濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mg·L－1。按“2.4”項(xiàng)下操作，以替硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，每一濃度平行3份，以樣品的峰面積計(jì)算其實(shí)際測算值。計(jì)算結(jié)果取平均值(Y)對去甲萬古霉素理論濃度(X)作線性回歸，得回歸方程為 Y=0.963 1X+0.068 2，r=0.996 8(n=6)。以信噪比(S/N)≥3計(jì)算最低檢測限為 2.5 mg·L－1。

2.6 回收率與精密度 制備去甲萬古霉素濃度分別為 5.0、20.0、80.0 mg·L－1的血清樣品，照“2.4”項(xiàng)下操作，每種濃度一天內(nèi)分別進(jìn)樣5次，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程帶入所測得樣品峰面積，計(jì)算血清濃度，用實(shí)測濃度和樣品濃度的比值表示方法回收率，計(jì)算RSD，得日內(nèi)差異。每日測定1次，連續(xù)測定5 d，計(jì)算RSD，得日間差異，結(jié)果見表1。

表1 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.7 穩(wěn)定性考察 配制含去甲萬古霉素5.0、20.0、80.0 mg·L－1三種濃度血清質(zhì)控樣品，分別在室溫下放置4 h，在－40℃凍融 1次、2次，以及－40℃冷凍1周、1個(gè)月的條件下，按“2.4”項(xiàng)下操作，每一濃度平行5次，計(jì)算各種條件下的實(shí)測值和RSD，考察其穩(wěn)定性。考察結(jié)果RSD＜10%，證明該方法完全符合去甲萬古霉素常規(guī)血藥濃度監(jiān)測的要求，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性考察(n=5)

2.8 干擾試驗(yàn) 考慮臨床普遍存在合并用藥的實(shí)際情況，試驗(yàn)考察了常用的頭孢哌酮、阿奇霉素、左氧氟沙星等抗感染藥物，抗真菌藥氟康唑以及潑尼松、甲潑尼龍、地塞米松等激素類藥物對去甲萬古霉素色譜行為的影響，均未發(fā)現(xiàn)上述藥物對樣品色譜峰有明顯干擾，滿足常規(guī)血藥濃度監(jiān)測要求。

2.9 臨床應(yīng)用 隨機(jī)抽取我院已持續(xù)規(guī)范使用去甲萬古霉素至少3 d的在院患者，分別于用藥前和用藥后10 min內(nèi)各抽樣一次，以用藥前血樣為谷濃度樣本，用藥后10 min內(nèi)血樣為峰濃度樣本［9］，按“2.4”項(xiàng)下操作，測得去甲萬古霉素濃度結(jié)果見表3，所測結(jié)果符合臨床實(shí)際。

表3 患者去甲萬古霉素血藥濃度監(jiān)測結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)過程中在使用流動(dòng)相前后用過渡相低壓灌注以防止流動(dòng)相中的KH2PO4在回路和色譜柱中析出。

尿素對去甲萬古霉素有助溶作用。使用2%尿素水溶液溶解去甲萬古霉素保證標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定，血樣處理時(shí)加入20%尿素助溶可以提高萬古霉素的響應(yīng)值。

［6］，含去甲萬古霉素的血樣處理都用沉淀蛋白——離心法，所用沉淀劑有硫酸鋅、高氯酸［7－8］，本試驗(yàn)采用15%高氯酸作為沉淀劑，加入助溶劑后高速離心，抽取上清液進(jìn)樣。使用15%高氯酸可以充分沉淀血清中蛋白質(zhì)，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

文獻(xiàn)報(bào)道［6－7］使用萬古霉素和去甲萬古霉素互為內(nèi)標(biāo)檢測兩者濃度，在實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)這兩者出峰位置較近，難以嚴(yán)格區(qū)分，且藥品去甲萬古霉素中一般都含有少量萬古霉素［10］，使用萬古霉素作為內(nèi)標(biāo)檢測去甲萬古霉素血藥濃度容易出現(xiàn)較大誤差。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)標(biāo)物替硝唑，與受試藥物去甲萬古霉素可完全分離，兩者完全無干擾?？紤]到上述兩藥合并使用的可能性，檢測去甲萬古霉素血藥濃度時(shí)必須明確患者是否同時(shí)使用替硝唑，否則測定結(jié)果會出現(xiàn)較大偏差。在患者并用去甲萬古霉素和替硝唑的前提下，可換用甲硝唑代替替硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)物。試驗(yàn)證明去甲萬古霉素與甲硝唑、替硝唑三者分離良好，均無干擾。

去甲萬古霉素有效血藥濃度谷、峰值參照萬古霉素有效血藥濃度谷、峰值設(shè)定［11］。為確保去甲萬古霉素抗感染治療的有效性和安全性，避免產(chǎn)生不良反應(yīng)，尤其是耳、腎毒性的發(fā)生與去甲萬古霉素的血藥濃度過高密切相關(guān)，臨床應(yīng)用時(shí)可依據(jù)監(jiān)測血藥濃度并及時(shí)調(diào)整用藥劑量以避免器官損害風(fēng)險(xiǎn)。特別是對于長期使用的患者、出生低體重兒、新生兒和幼兒，與可引起腎臟及聽力損害的藥物(如慶大霉素、鏈霉素、兩性霉素B)［12］聯(lián)用的患者。

去甲萬古霉素抗菌活性近似于萬古霉素，合適的血藥濃度對于敏感細(xì)菌有較好的抑制、殺滅作用，可替代萬古霉素用于當(dāng)其他藥物如青霉素或患者不能耐受的嚴(yán)重葡萄球菌或其他革蘭陽性菌感染，特別是用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染。去甲萬古霉素長期使用時(shí)峰濃度不宜超過 30～40 mg·L－1，谷濃度需要 10～15 mg·L－1，治療低敏感性MRSA感染時(shí)谷濃度可保持 15 ～20 mg·L－1［13］。去甲萬古霉素存在一定程度的暴露－耳、腎毒性，當(dāng)用藥后出現(xiàn)血清肌酐升高可定義為腎臟毒性，由于密集用藥會增加腎臟毒性，為治療MRSA感染而使用高劑量去甲萬古霉素時(shí)需格外關(guān)注;使用去甲萬古霉素時(shí)需作聽力監(jiān)測，特別是高?；颊撸霈F(xiàn)耳鳴時(shí)應(yīng)立即停用去甲萬古霉素。

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