大別山區(qū)仿野生栽培茯苓中茯苓多糖和茯苓酸含量研究

杜方平，陳衛(wèi)東，朱月健，賈步云，俞年軍，楊青山，金傳山，季兆潔，彭代銀

(1.金寨縣金山寨食(藥)用菌種植專(zhuān)業(yè)合作社，安徽六安 237300;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心;4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所，安徽合肥 230012;5.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽亳州 236800)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。茯苓甘，淡，性平，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕，健脾和胃，寧心安神等功效，用于治療水腫，小便不利等［1］。在傳統(tǒng)中藥組方中，茯苓的配伍率極高，因而有“十方九苓”之說(shuō)。一些經(jīng)典的組方一直沿用至今，并與西藥相結(jié)合對(duì)于一些疾病有良好的治療效果，如桂枝茯苓湯。臨床研究表明，桂枝茯苓湯對(duì)于慢性盆腔炎［2-4］、腎炎［5］以及子宮肌瘤［6］都有很好的輔助治療效果。同時(shí)，另有研究表明，以該方為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的茯苓桂枝膠囊對(duì)于月經(jīng)不調(diào)不孕癥有一定的治療效果［7］。茯苓中具有多種活性成分，包括茯苓三萜，茯苓多糖、樹(shù)膠、蛋白質(zhì)和脂肪等。其中茯苓三萜類(lèi)化合物主要包括茯苓酸、土莫酸等、茯苓多糖主要包括β-茯苓聚糖、羧甲基茯苓多糖、茯苓次聚糖、木糖醇以及纖維素等。藥理研究表明，茯苓三萜的主要藥理活性為抗炎，利尿，抗氧化活性以及抑菌活性［8］，而茯苓多糖的活性主要表現(xiàn)為能夠提高機(jī)體的免疫力［9-10］。本研究采用儀器分析手段，測(cè)定大別山仿野生栽培茯苓中茯苓多糖以及茯苓酸的含量，探索不同茯苓樣品中有效成分含量的差異，為茯苓藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善以及培育具有優(yōu)良遺傳特性菌種提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-15C高效液相色譜儀:日本島津公司;UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精科公司;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;AB125-S型十萬(wàn)分之一分析天平:德國(guó)梅特勒公司;KQ-300B型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料 仿野生栽培茯苓樣品6份:采集于大別山區(qū)野生環(huán)境(1號(hào)取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)桐崗村關(guān)廟組，栽培場(chǎng)坐北向南，砂壤土質(zhì)，海拔150 m，坡度20°;2號(hào)取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)東沖村培塘組，栽培場(chǎng)坐東向西，黃砂壤土質(zhì)，海拔230 m，坡度25°左右;3號(hào)取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)秦灣村紅毛田組，栽培場(chǎng)坐東南向西北，黃砂壤土質(zhì)，海拔200 m，坡度45°左右;4號(hào)取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)龍?zhí)洞宕鬄辰M，栽培場(chǎng)坐西北向東南，黃壤土質(zhì)，海拔185 m，坡度35°;5號(hào)取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)龍?zhí)洞宕鬄辰M，栽培場(chǎng)坐西北向東南，黃壤土質(zhì)，海拔185 m，坡度35°，原生松蔸邊地下3寸左右外;6號(hào)取自金寨縣天堂寨鎮(zhèn)鼓樓村，栽培場(chǎng)坐北向南，砂壤土細(xì)，海拔665 m，坡度30°);無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100736-202423，純度:100%;茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品:上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):YJ0616SA14，純度≥98%;乙腈(色譜純):上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?甲醇(色譜純):上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?磷酸(分析純):江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;

2 茯苓多糖含量研究

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度線，即得0.1 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，放置于4℃條件下保存。

2.2 供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取過(guò)60目篩的仿野生栽培茯苓樣品粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，加入50 mL純水，超聲30 min后用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10 mL定容至50 mL容量瓶，即得供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 試管中，補(bǔ)加純水至1 mL，再加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸4 mL，沸水浴25 min，冰水浴15 min。取出后，補(bǔ)足減失體積，在490 nm處測(cè)定其吸光度(A)，以濃度(C)對(duì)其做回歸方程，回歸方程為A=8.0246C-0.0019(r=0.999 5)。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL至10 mL試管中，同前法操作后，連續(xù)測(cè)定吸光度5次，RSD值為1.71%，表明該方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密移取5份樣品溶液1.0 mL至10 mL試管中，同前法操作后，連續(xù)測(cè)定吸光度5次，RSD值為1.03%，表明該方法重復(fù)性符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL至10 mL 試管中，同前法操作后，于 0、1、2、3、4、5 h測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD值為0.98%，說(shuō)明樣品在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取0.5 mL已知含量的樣品溶液，平行5份，分別精密加入0.5 mL葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.1 g·mL-1)，同前法操作后，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算得平均加樣回收率為99.04%，RSD為0.63%，符合測(cè)定要求。

2.8 樣品中茯苓多糖含量測(cè)定［11］取各仿野生栽培茯苓樣品，按“2.2供試品溶液的配制”項(xiàng)下方法，配制供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5 mL，加純水至1 mL加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸4 mL，沸水浴25 min，冰水浴15 min。取出后，補(bǔ)足減失體積，在490 nm處測(cè)定其吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同仿野生栽培茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，分別為 1.259%、2.169%、2.392%、2.830%、4.186%、0.709%。

3 茯苓酸含量研究

3.1 色譜條件 島津LC-15C高效液相色譜儀(包括LC-15C高壓輸液泵、SPD-15C紫外檢測(cè)器);色譜柱:COSMOSIL C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶0.4%乙酸(80∶20);柱溫:30℃;進(jìn)樣量 20μL;流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm。見(jiàn)圖1。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱(chēng)取茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品1.50 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得150 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4℃冰箱保存。

3.3 供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取過(guò)60目篩的仿野生栽培茯苓樣品粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，加入30 mL甲醇，浸泡30 min，超聲90 min，過(guò)濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復(fù)溶并定容至10 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密移取茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成15、30、60、75、100、120、135、150、300 g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，搖勻及過(guò)濾后，進(jìn)樣分析，以峰面積(Y)對(duì)茯苓酸的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程:Y=200.83X-7.8316(r=0.999 9)，表明茯苓酸在15～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于0、0.5、1、2、3、4、5 h進(jìn)樣分析，結(jié)果茯苓酸峰面積的RSD為1.45%，表明茯苓酸的供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 精密度試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液150 mg·L-1，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定茯苓酸峰面積，計(jì)算茯苓酸峰面積的RSD值為0.69%。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“3.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算茯苓酸峰面積RSD值為1.74%。

3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取0.5 mL已知茯苓酸含量的供試品溶液，平行5份，每份精密加入0.5 mL茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(150 mg·L-1)，用流動(dòng)相配成合適濃度，進(jìn)樣分析，計(jì)算得平均加樣回收率為99.11%，RSD 為 0.53%。

3.9 樣品中茯苓酸含量測(cè)定［12-13］取各仿野生栽培茯苓樣品，按“3.3供試品溶液的配制”項(xiàng)下方法，配制供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5 mL，稀釋至1.5 mL，用 0.45 μm 過(guò)濾后進(jìn)樣分析，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同仿野生栽培茯苓樣品中茯苓酸的百分含量分別為0.697%、0.598%、0.781%、0.818%、0.777%、0.441%。

4 結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，在6個(gè)不同的大別山仿野生栽培茯苓樣品中5號(hào)樣品茯苓多糖的含量(4.186%)最高，4號(hào)樣品的茯苓酸含量(0.818%)最高。4號(hào)和5號(hào)仿野生栽培茯苓生長(zhǎng)地的生境是一致的，均為金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)龍?zhí)洞宕鬄辰M，栽培場(chǎng)坐西北向東南，黃壤土質(zhì)，海拔185 m，坡度35°，說(shuō)明該地采用仿野生栽培技術(shù)栽培出的茯苓較其它場(chǎng)地更優(yōu)。

5 討論

本文建立了準(zhǔn)確、快速且重現(xiàn)性好的的仿野生栽培茯苓中茯苓多糖的分光光度測(cè)定方法以及茯苓酸的HPLC分析方法，為茯苓的質(zhì)量控制研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了參考。同時(shí)本研究篩選出了大別山區(qū)不同仿野生栽培茯苓樣品中茯苓多糖與茯苓酸含量較高的茯苓樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為后期菌種的分離及擴(kuò)繁提供依據(jù)。目前大別山區(qū)很多茯苓種植單位，并不重視茯苓菌種的篩選，尤其是對(duì)于其有效成分的含量關(guān)注的較少，嚴(yán)重影響了栽培茯苓的質(zhì)量。因而，菌種擴(kuò)繁前的有效成分的測(cè)定，對(duì)于生產(chǎn)高品質(zhì)茯苓藥材具有十分重要的意義。

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