高效液相色譜法與容量分析法測定發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖含量的比較

葛馳宇，張君麗

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥與健康管理學(xué)院，江蘇淮安 223003;2.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009)

L-赤蘚酮糖(L-erythrulose)在醫(yī)藥和化妝品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用:涂敷添加L-赤蘚酮糖的化妝品具有消除魚尾紋、保濕等作用［1-3］;L-赤蘚酮糖是合成一些具有重要生物活性和藥用價(jià)值化合物的前體［4］;從L-赤蘚酮糖出發(fā)可以合成某些立體特異性的具有藥用價(jià)值的L型化合物，解決了許多對(duì)立體特異性要求很高的復(fù)雜抗病毒藥物前體尋找困難的問題，對(duì)藥物的手性合成具有重要的意義［5-6］。

L-赤蘚酮糖的制備方法通常是在某些氧化桿菌作用下由赤蘚糖醇發(fā)酵生產(chǎn)獲得，需要建立合適的檢測方法來確定發(fā)酵終點(diǎn)。測定L-赤蘚酮糖的含量的方法主要有氣相色譜法［7-8］、紫外分光光度法［9］和薄層色譜法［10］。氣相色譜法需要對(duì) L-赤蘚酮糖進(jìn)行衍生化，預(yù)處理復(fù)雜，且供試品中的水分對(duì)衍生化過程有很大影響;紫外分光光度計(jì)只有吸光度值在0.3～0.7范圍內(nèi)測得的數(shù)據(jù)才準(zhǔn)確，發(fā)酵液一般需要稀釋到該量程范圍內(nèi)方可進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，但是隨著稀釋倍數(shù)的不斷增大，精密度也逐漸下降。薄層色譜法常用于定性，很難用于定量分析。為此，本文建立了高效液相色譜法來測定發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的含量，并與傳統(tǒng)的測定還原糖的方法斐林試劑滴定法進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 L-赤蘚酮糖對(duì)照品溶液(HPLC純度為85%)美國Sigma公司;甲醇色譜純;酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、次甲基藍(lán)、黃血鹽分析純。安捷倫1100高效液相色譜儀美國Agilent有限公司;25 mL滴定管，電爐。

1.2 L-赤蘚酮糖供試品的制備 將木醋桿菌接種至種子培養(yǎng)基(10 g·L-1酵母粉，80 g·L-1葡萄糖)培養(yǎng)30 h，再取5 mL種子液接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(100 g·L-1赤蘚糖醇，5 g·L-1酵母粉，5 g·L-1蛋白胨)中，取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液樣品8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，所得濾液用流動(dòng)相稀釋適當(dāng)倍數(shù)即得L-赤蘚酮糖供試品。

1.3 高效液相色譜法(HPLC)

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Lichrospher 5-NH2(4.6 mm×250 mm);柱溫:32℃;流動(dòng)相:甲醇—水(85∶15，V/V);流速:1.0 mL·min-1。用紫外檢測器在室溫下檢測L-赤蘚酮糖，檢測波長為277 nm，檢測器溫度為35℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取L-赤蘚酮糖對(duì)照品溶液適量定容于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相制成100.00 g·L-1的儲(chǔ)備液，再用其稀釋成 0.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00和 100.00 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度分別進(jìn)樣20μL，測定3次，取峰面積平均值，以峰面積平均值為縱坐標(biāo)(Y)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，得到線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。以信噪比為3時(shí)樣品的濃度為最低檢測限，信噪比為10時(shí)的樣品濃度確定最低定量限。

1.3.3 專屬性考察 在測定發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖含量時(shí)，由于發(fā)酵液中成分比較復(fù)雜，因此需要考察這些物質(zhì)對(duì)L-赤蘚酮糖的測定是否會(huì)產(chǎn)生干擾。我們分別考察不含L-赤蘚酮糖的空白發(fā)酵培養(yǎng)基、含有L-赤蘚酮糖的發(fā)酵培養(yǎng)基和L-赤蘚酮糖供試品溶液。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 在L-赤蘚酮糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍里選擇低、中、高三個(gè)濃度，配制各濃度的對(duì)照品溶液樣品。每個(gè)濃度樣品分別在同一天內(nèi)和不同天內(nèi)連續(xù)測定6次，分別考察每一濃度樣品同一天內(nèi)測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，獲得日內(nèi)精密度;分別考察每一濃度樣品不同天之間測定結(jié)果的RSD，獲得日間精密度。

1.3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 在L-赤蘚酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍里選擇低、中、高三個(gè)濃度，配制各濃度的對(duì)照品溶液樣品，每個(gè)濃度樣品配制6份，分別加入空白發(fā)酵培養(yǎng)基，計(jì)算每一濃度的加樣平均回收率和RSD。

1.4 容量分析法(VA) 由于L-赤蘚酮糖屬于還原糖，故我們采用經(jīng)典的斐林試劑滴定法。斐林試劑的配制、操作與計(jì)算方法同文獻(xiàn)［11］，以L-赤蘚酮糖代替葡萄糖進(jìn)行操作。

1.4.1 VA法標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取L-赤蘚酮糖對(duì)照品溶液適量，分別置于50 mL和100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，得300.00 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液A和10.00 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液B(其中B液用于斐林試劑法測定使用)。分別精密吸取若干體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液A置于10 mL容量瓶中稀釋成 6.00、10.00、40.00、80.00、120.00、200.00、300.00 g·L-1。按文獻(xiàn)［11］中步驟操作，以消耗的L-赤蘚酮糖標(biāo)準(zhǔn)溶液B的體積(mL)為縱坐標(biāo)(Y)，以L-赤蘚酮糖標(biāo)準(zhǔn)溶液A不同稀釋液的濃度(g·L-1)為橫坐標(biāo)(X)，得到線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.4.2 VA法其它指標(biāo)考察 除了考察VA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線外，還考察VA法的專屬性、精密度和回收率，考察方法同HPLC法。

1.5 HPLC和VA法檢測發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖含量的比較 分別收集8、16、24、32、40和48 h的發(fā)酵液樣品，適當(dāng)處理之后用兩種方法同時(shí)檢測其中L-赤蘚酮糖的含量，每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品平行測定三次，取平均值并求得RSD。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測兩種方法之間是否存在顯著性差異。F檢驗(yàn)通過比較兩組數(shù)據(jù)的均方偏差以確定二者的精密度之間是否存在顯著性差異，t檢驗(yàn)用于測定兩種方法的樣本均值之間是否存在顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HPLC 法

2.1.1 HPLC法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 由實(shí)驗(yàn)可得，L-赤蘚酮糖在 1.00 ～100.00 g·L-1的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y=216 424X-308 951，R2=0.999 9，最低檢測限為 0.50 g·L-1，最低定量限為 0.85 g·L-1。

2.1.2 HPLC法專屬性考察 取空白發(fā)酵培養(yǎng)基(A)、含L-赤蘚酮糖對(duì)照品的發(fā)酵培養(yǎng)基(B)和L-赤蘚酮糖供試品(C)分別進(jìn)樣。所得結(jié)果如圖1B所示，L-赤蘚酮糖的出峰時(shí)間在9 min左右。通過比較，由圖1A和1C可以看出在L-赤蘚酮糖的出峰位置沒有底物赤蘚糖醇和其他明顯雜質(zhì)峰出現(xiàn)，從而推斷本法不受發(fā)酵液其它組分干擾。

2.1.3 HPLC法精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取L-赤蘚酮糖對(duì)照品溶液分別配制成 5.00、20.00 和80.00 g·L-1低、中、高三個(gè)濃度。用“1.3.1”下述 HPLC 色譜條件日內(nèi)重復(fù)測定6次，日內(nèi) RSD分別為0.44%、0.58%、0.35%。同法測定的三個(gè)濃度樣品每天測定一次，連續(xù)測定6 d，日間 RSD分別為0.24%、0.79%、0.86%。結(jié)果見表 1。結(jié)果表明，HPLC法測定L-赤蘚酮糖含量時(shí)精密度良好。

表1 HPLC法測定L-赤蘚酮糖的精密度實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

表1 HPLC法測定L-赤蘚酮糖的精密度實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

加入量/g·L-1日內(nèi)測得量/g·L-1日內(nèi)RSD/%日間測得量/g·L-1日間RSD/%5.00 5.08 ±0.12 0.44 4.92 ±0.14 0.24 20.00 19.94 ±0.22 0.58 20.11 ±0.20 0.79 80.00 80.13 ±1.08 0.35 80.05 ±0.77 0.86

2.1.4 HPLC 法回收率實(shí)驗(yàn) 配制 5.00、20.00、80.00 g·L-1低、中、高三個(gè)濃度的 L-赤蘚酮糖對(duì)照品溶液樣品各6份，分別加入空白發(fā)酵培養(yǎng)基中，按1.3.1下述HPLC條件進(jìn)行測定。結(jié)果見表2，結(jié)果表明HPLC法的回收率高，重現(xiàn)性好。

表2 HPLC法測定L-赤蘚酮糖的回收率實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

表2 HPLC法測定L-赤蘚酮糖的回收率實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

加入量/g·L-1 測得量/g·L-1 回收率/% RSD/%5.00 5.09 ±0.17 101.8 0.74 20.00 20.10 ±0.26 100.5 1.12 80.00 79.93 ±0.87 99.9 0.47

2.2 VA 法

2.2.1 VA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 由實(shí)驗(yàn)可得，L-赤蘚酮糖在6.00～300.00 g·L-1的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y=0.018 9X+0.012 9，R2=0.983 0。

2.2.2 VA法專屬性考察 用VA法測定空白發(fā)酵培養(yǎng)基中L-赤蘚酮糖的含量，滴定結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白發(fā)酵培養(yǎng)基(A)顏色始終沒有發(fā)生變化，含L-赤蘚酮糖對(duì)照品的發(fā)酵培養(yǎng)基(B)和L-赤蘚酮糖供試品(C)測定結(jié)果相同，證明底物赤蘚糖醇和發(fā)酵液中其它成分沒有對(duì)VA法產(chǎn)生干擾。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 配制 15.00、80.00、250.00 g·L-1低、中、高三個(gè)濃度的L-赤蘚酮糖對(duì)照品溶液樣品，用VA法日內(nèi)重復(fù)測定6次，日內(nèi)RSD分別為1.48%、1.83%、2.68%。同法測定的三個(gè)濃度樣品，每天測定一次，連續(xù)測定6 d，日間RSD分別為 1.85%、2.43% 、2.47%。結(jié)果見表 3。結(jié)果表明本文使用的VA法的精密度均大于容量滴定法的最低RSD要求0.3%，結(jié)果不理想。

表3 VA法測定L-赤蘚酮糖的精密度實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

表3 VA法測定L-赤蘚酮糖的精密度實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

加入量/g·L-1日內(nèi)測得量/g·L-1日內(nèi)RSD/%日間測得量/g·L-1日間RSD/%15.00 14.37 ±1.72 1.48 14.03 ±1.27 1.85 80.00 78.45 ±6.63 1.83 78.19 ±5.43 2.43 250.00 242.16 ±16.99 2.68 241.03 ±14.79 2.47

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 配制 15.00、80.00、250.00 g·L-1低、中、高三個(gè)濃度的L-赤蘚酮糖的對(duì)照品溶液樣品，分別加入空白發(fā)酵培養(yǎng)基中，用VA法進(jìn)行測定。結(jié)果見表4。結(jié)果表明本文使用的VA法的回收率在91.73% ～97.15%之間，結(jié)果也不理想。

表4 VA法測定L-赤蘚酮糖的回收率實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

表4 VA法測定L-赤蘚酮糖的回收率實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

加入量/g·L-1 測得量/g·L-1 回收率/% RSD%15.00 13.76 ±2.08 91.73 3.72 80.00 78.19 ±3.70 97.73 2.34 250.00 242.87 ±13.11 97.15 2.20

2.3 HPLC法和VA法測定發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖含量的比較 由表5可得，VA法測定的RSD均大于0.3%，而HPLC法的RSD均在規(guī)定范圍≤1.5%之內(nèi)，表明測定發(fā)酵液中 L-赤蘚酮糖樣品含量HPLC法比VA法可靠。

表5 HPLC和VA法測定L-赤蘚酮糖含量的結(jié)果比較(±s，n=6)

表5 HPLC和VA法測定L-赤蘚酮糖含量的結(jié)果比較(±s，n=6)

取樣時(shí)間/h HPLC法±s RSD/%VA法±s RSD/%8 7.88 ±0.10 0.28 6.03 ±0.21 1.87 16 37.52 ±0.27 0.25 29.37 ±1.58 2.39 24 74.66 ±0.23 0.39 67.82 ±2.49 1.52 32 84.78 ±0.29 0.25 81.73 ±3.72 2.56 40 89.24 ±0.18 0.17 83.68 ±3.92 1.98

3 討論

VA法屬于滴定操作法，容易出現(xiàn)誤差，數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，但與所有其他檢測方法相比，VA法設(shè)備便宜易得，占用空間較小，操作簡便，耗時(shí)短，在對(duì)測量準(zhǔn)確度和精密度要求不高，或者只需大致預(yù)估L-赤蘚酮糖含量的情況下可以采用該法。

高效液相色譜法測定還原糖采用的最佳的色譜柱為鈣柱［12-14］，但是鈣色譜柱應(yīng)用范圍狹窄，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室不常配置。而在實(shí)驗(yàn)室常備的色譜柱中常用于糖類物質(zhì)檢測的是氨基柱，即以-NH2為固定相，以不同比例的甲醇與水的混合物為流動(dòng)相。在先前的研究中［15］，以乙腈和水作為流動(dòng)相，分離度較高，但是乙腈價(jià)格較高，我們選擇了市售價(jià)格約為乙腈1/5的甲醇—水(85∶15，V/V)作為流動(dòng)相，并適當(dāng)提高柱溫，獲得了相同的分離效果。L-赤蘚酮糖結(jié)構(gòu)中的酮基有若干個(gè)紫外吸收峰，為了排除流動(dòng)相的干擾，我們選擇了272～289 nm范圍內(nèi)的最大吸收峰277 nm處進(jìn)行檢測。在發(fā)酵過程結(jié)束后，除了產(chǎn)物L(fēng)-赤蘚酮糖外，還有未被菌體利用完的培養(yǎng)基與菌體的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而待測物質(zhì)與雜質(zhì)完全分開是進(jìn)行測定的前提，本文建立的檢測方法中，L-赤蘚酮糖沒有與其它雜質(zhì)峰發(fā)生重疊，完全不受其它雜質(zhì)影響。

總之，與其他檢測方法尤其是容量分析法相比，本文建立的高效液相色譜法預(yù)處理簡單，不需要衍生化，分辨率高，重現(xiàn)性好。

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