草銨膦在甘蔗愈傷分化階段和剛成苗階段篩選濃度的確定

何慧怡，樊麗娜，齊永文，勞方業(yè)，鄧海華

(廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510316)

草銨膦在甘蔗愈傷分化階段和剛成苗階段篩選濃度的確定

何慧怡，樊麗娜，齊永文*，勞方業(yè)，鄧海華

(廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510316)

本試驗(yàn)以甘蔗品種ROC22和粵糖93-159的愈傷組織和剛分化4周小苗為試驗(yàn)材料，初步確定了草銨膦在愈傷組織分化階段和剛分化4周小苗階段的篩選濃度。綜合試驗(yàn)結(jié)果，適合草銨膦在ROC22和粵糖93-159愈傷組織分化階段的篩選濃度為2.5 μmol/L；適合草銨膦對(duì)ROC22剛分化4周小苗的篩選濃度為5.5 μmol/L，適合草銨膦對(duì)粵糖93-159剛分化4周小苗的篩選濃度為6.6 μmol/L。

草銨膦；甘蔗；篩選濃度

0 引言

甘蔗是重要的糖料作物，也是制糖工業(yè)的重要支柱[1]。采用化學(xué)除草劑防治蔗園雜草來(lái)代替人工及機(jī)械除草，是一項(xiàng)已在世界上廣泛應(yīng)用的技術(shù)。它具有防治成本低、節(jié)省工時(shí)、減輕勞動(dòng)強(qiáng)度、能及時(shí)有效地防除雜草、保證蔗株正常生長(zhǎng)而獲高產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。但化學(xué)除草劑若使用不當(dāng)，則會(huì)造成藥害，使甘蔗不能正常生長(zhǎng)而導(dǎo)致減產(chǎn)。因此生產(chǎn)上對(duì)具有抗除草劑抗性的甘蔗品種需求越來(lái)越大。

草銨膦(Glufosinate-Ammonium)是德國(guó)赫斯特

公司創(chuàng)制的有機(jī)磷類非傳導(dǎo)滅生性除草劑，具有活性高、低毒、環(huán)境兼容性好等特點(diǎn)。目前，對(duì)草銨膦具有抗性的作物基本上都是通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法獲得的[4-6]。在甘蔗育種方面，與其他作物相似，Bar基因常被作為目的基因的選擇標(biāo)記而轉(zhuǎn)入甘蔗體內(nèi)，從而使得這些轉(zhuǎn)基因甘蔗具有目的性狀的同時(shí)也具有對(duì)草銨膦的抗性[7-10]。近年來(lái)除了轉(zhuǎn)基因育種外，還出現(xiàn)了誘變育種等新育種方法[11-13]，通過(guò)新育種方法選育具除草劑抗性的甘蔗品種可以縮短育種年限，提高育種效率。因此確定草銨膦在甘蔗組培階段的篩選濃度，對(duì)轉(zhuǎn)基因育種及誘變育種等后期抗性篩選階段有積極意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘蔗品種ROC22和粵糖93-159的愈傷組織以及這兩品種剛分化4周的小苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草銨膦在愈傷組織分化階段篩選濃度的確定

把ROC22和粵糖93-159的愈傷組織接入含有草銨膦0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μmol/L的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基里，對(duì)照組不加草銨膦。4周后調(diào)查愈傷組織的轉(zhuǎn)綠率和愈傷成苗率情況。轉(zhuǎn)綠率為長(zhǎng)出綠點(diǎn)或分化出小苗的愈傷組織的塊數(shù)與接種的愈傷組織總塊數(shù)的百分比。愈傷成苗率為分化出小苗的愈傷組織塊數(shù)與接種的愈傷組織總塊數(shù)的百分比。

1.2.2 草銨膦在剛分化4周小苗階段篩選濃度的確定

把ROC22和粵糖93-159剛分化4周的小苗接入含有草銨膦1.0、2.5、4.0、5.0和7.5 μmol/L的小苗增殖培養(yǎng)基里，對(duì)照組不加草銨膦。4周后調(diào)查草銨膦對(duì)分化小苗的的致死率和苗的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織在不同濃度草銨膦中的轉(zhuǎn)綠率

ROC22和粵糖93-159的愈傷組織在不同濃度草銨膦中培養(yǎng)4周后的轉(zhuǎn)綠率見圖1和圖2。從圖1和圖2可以看出，2個(gè)基因型甘蔗的愈傷組織轉(zhuǎn)綠率都隨著草銨膦濃度的升高而下降，粵糖93-159愈傷組織分化時(shí)對(duì)草銨膦的耐受濃度稍高于ROC22。

圖1 ROC22愈傷組織在不同草銨膦濃度中的轉(zhuǎn)綠率

2.2 愈傷組織在不同濃度草銨膦中的成苗情況

ROC22和粵糖93-159的愈傷組織在不同濃度的草銨膦中培養(yǎng)4周后的成苗情況見表1、圖3和圖4。

圖2 粵糖93-159愈傷組織在不同草銨膦濃度中的轉(zhuǎn)綠率

表1 愈傷組織在不同濃度草銨膦中的成苗情況

2個(gè)基因型甘蔗愈傷組織的成苗率隨著草銨膦濃度的提高而下降，且分化的成苗情況也隨之轉(zhuǎn)差。當(dāng)草銨膦濃度為2.5 μmol/L時(shí)，愈傷組織雖然能部分分化出苗，但是苗的長(zhǎng)勢(shì)很差，苗姿不正常，苗矮小，且葉片短小卷曲。

圖3 ROC22愈傷組織在不同草銨膦濃度中分化培養(yǎng)4周后的生長(zhǎng)情況

圖4 粵糖93-159愈傷組織在不同草銨膦濃度中分化培養(yǎng)4周后的生長(zhǎng)情況

2.3 剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中的致死率及生長(zhǎng)情況

ROC22和粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中培養(yǎng)4周后的致死率見圖5和圖6。草銨膦對(duì)2個(gè)基因型甘蔗剛分化小苗的致死率都隨著草銨膦濃度的升高而升高。根據(jù)趨勢(shì)線推算，草銨膦對(duì)ROC22剛分化小苗的LD50為5.5 μmol/L，對(duì)粵糖93-159剛分化小苗的LD50為6.6 μmol/L。

圖5 ROC22剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中的致死率

圖6 粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度 草銨膦中的致死率

ROC22和粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中培養(yǎng)4周后的生長(zhǎng)情況見圖7和圖8。隨著草銨膦濃度的升高，小苗的生長(zhǎng)情況均受到不良影響，2個(gè)基因型甘蔗之間差異不大，苗變矮小，分蘗減少，葉片變短小，葉色變淺、枯黃。當(dāng)草銨膦濃度為7.5 μmol/L時(shí)，大部分小苗已枯黃死亡，存活的小苗也基本沒有生長(zhǎng)，葉片短小并有褐斑。

圖7 ROC22剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中分化培養(yǎng)4周后的生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論

ROC22和粵糖93-159的愈傷組織轉(zhuǎn)綠率都隨著草銨膦濃度的升高而下降，這說(shuō)明除草劑對(duì)愈傷組織的分化有負(fù)影響。不同基因型甘蔗的愈傷組織對(duì)除草劑的耐受濃度稍有差異。在本次試驗(yàn)中草銨膦濃度為2.5 μmol/L時(shí)，2個(gè)甘蔗基因型愈傷組織的轉(zhuǎn)綠率均大于50%，從成苗的情況看，有很多愈傷組織雖然能轉(zhuǎn)綠，但隨著除草劑濃度的增加所成

苗的數(shù)量和質(zhì)量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，部分愈傷組織只轉(zhuǎn)綠而不能分化成小苗。所以結(jié)合成苗情況，適合草銨膦在甘蔗愈傷組織分化階段的篩選濃度為2.5 μmol/L。

草銨膦對(duì)ROC22和粵糖93-159剛分化4周小苗的致死率隨著處理濃度的增加而增高。不同基因型甘蔗剛分化的小苗對(duì)除草劑的耐受濃度稍有差異。在本試驗(yàn)中根據(jù)趨勢(shì)線推算，草銨膦對(duì)ROC22剛分化小苗的LD50為5.5 μmol/L，對(duì)粵糖93-159剛分化小苗的LD50為6.6 μmol/L。從小苗的生長(zhǎng)狀況看，當(dāng)草銨膦濃度為5 μmol/L時(shí)存活的小苗矮小，葉片短小發(fā)黃，當(dāng)草銨膦為7.5 μmol/L時(shí)，大部分小苗已枯黃死亡，存活的小苗也基本沒有生長(zhǎng)，且葉片短小并有褐斑。因此結(jié)合小苗的生長(zhǎng)狀況，對(duì)剛分化的小苗適合ROC22篩選的草銨膦濃度為5.5 μmol/L，適合粵糖93-159篩選的草銨膦濃度為6.6 μmol/L。

圖8 粵糖93-159剛分化4周小苗在不同濃度草銨膦中分化培養(yǎng)4周后的生長(zhǎng)情況

4 討論

本試驗(yàn)初步確立了ROC22和粵糖93-159愈傷組織分化階段和剛分化4周小苗的草銨膦篩選濃度，為日后的誘變育種、轉(zhuǎn)基因育種等后期抗性篩選階段提供參考。但同時(shí)不同基因型甘蔗品種的愈傷組織和剛分化小苗對(duì)草銨膦的耐受濃度均有差異，因此日后還需針對(duì)試驗(yàn)的甘蔗品種做相應(yīng)的篩選濃度試驗(yàn)。

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(本篇責(zé)任編校：李金玉)

Studies on the Embryo Germination Medium and Plant Regeneration Medium with the Optimum Concentrations of Glufosinate-Ammonium for Sugarcane

HE Hui-yi, FAN Li-na, QI Yong-wen, LAO Fang-ye, DENG Hai-hua
(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316)

In vitro glufosinate-ammonium selection regimes were respectively used to screen plants regeneration from callus and regenerated shoots (data recorded 4w after embryogenic callus were transferred to embryo germination medium) of ROC22 and YT93-159 for glufosinate-ammonium tolerance in this study. The highseverity treatments with high glufosinate-ammonium concentration which resulted in the necrosis of embryo germination or regenerated shoots were different for the different sugarcane cultivars. In conclusion, when the selection of herbicide-tolerant cell lines of sugarcane was applied to embryogenic callus, incorporating 2.5 μmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of embryo germination from callus of the two cultivars was the optimum. When the selection of herbicide-tolerant cell lines of sugarcane was applied to shoot regeneration, incorporating 5.5 μmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of regenerated shoots of ROC22 was the optimum, and incorporating 6.6 μmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of regenerated shoots of YT93-159 was the optimum.

Glufosinate-ammonium; Sugarcane; Concentration

S566.1

A

1005-9695(2015)01-0005-06

2014-11-25；

2015-01-13

本研究由廣東省科技計(jì)劃（2012A090300015; 2012B020301008; 2012A061400005）共同資助

何慧怡(1981-)，女，農(nóng)藝師，主要研究方向：甘蔗遺傳育種；E-mial：emil06@126.com

*通訊作者：齊永文(1978-)，男，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要研究方向：甘蔗遺傳育種；E-mail：yongwen2001@163.com

何慧怡，樊麗娜，齊永文，等. 草銨膦在甘蔗愈傷分化階段和剛成苗階段篩選濃度的確定[J]. 甘蔗糖業(yè)，2015(1)：5-10.