人類免疫缺陷病毒耐藥檢測研究進(jìn)展

邱宇鶴 何淑云 王 錦

吉林省吉林市疾病預(yù)防控制中心，吉林吉林 132001

近年來艾滋病抗病毒治療工作呈現(xiàn)全球性的迅速發(fā)展，接受有效的抗病毒治療對于抑制病毒復(fù)制，降低發(fā)病率和死亡率，提高生命質(zhì)量具有重要意義。但目前人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）耐藥已成為抗病毒治療的重要問題，不僅會(huì)影響個(gè)體自身治療，并且會(huì)引起耐藥毒株傳播流行的社會(huì)風(fēng)險(xiǎn)。面對HIV耐藥現(xiàn)狀，開展耐藥檢測不僅能夠指導(dǎo)評(píng)估、選擇和優(yōu)化調(diào)整臨床治療方案，還能夠?yàn)榉治瞿退幎局甑牧餍袪顩r、有效制定公共衛(wèi)生防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 HIV耐藥現(xiàn)狀

用于艾滋病治療的抗病毒藥物現(xiàn)已發(fā)展至6大類［1］，而治療方案也發(fā)展為不同分子靶點(diǎn)的多種藥物聯(lián)合作用，但是耐藥的出現(xiàn)嚴(yán)重影響治療效果，并且隨著抗病毒治療的推廣普及，HIV耐藥在全球已呈廣泛流行趨勢。Pham等［2］在2014年的一項(xiàng)系統(tǒng)性研究中指出，2009～2013年中/低收入國家高危人群的耐藥率較2004～2008年升高了近一倍，形勢非常嚴(yán)峻。更值得重視的是，耐藥的發(fā)生不止針對一線藥物，隨著新的抗病毒藥物及治療方案的應(yīng)用，新的耐藥突變也在不斷出現(xiàn)，當(dāng)前HIV耐藥已經(jīng)成為導(dǎo)致抗病毒治療失敗的主要因素［3］。

HIV耐藥是指HIV在通常能夠抑制其復(fù)制的藥物存在情況下復(fù)制的能力［4］，病毒逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，復(fù)制過程中存在高頻錯(cuò)誤傾向（約3×10-5突變/堿基/復(fù)制周期）［5］，而病毒高速復(fù)制的特點(diǎn)加速了感染進(jìn)程中病毒突變的積累，在機(jī)體自身免疫和抗病毒藥物的選擇壓力下篩選出耐藥優(yōu)勢株。如果患者服藥依從性低引起血藥濃度波動(dòng)，會(huì)增加發(fā)生耐藥的危險(xiǎn)，對云南德宏州艾滋病患者接受抗病毒治療后耐藥突變情況的研究發(fā)現(xiàn)［6］，在353例成功進(jìn)行耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)突變檢測的患者中，有198例（56.1％）發(fā)現(xiàn)耐藥基因突變。HIV耐藥不但會(huì)影響患者自身治療效果，更會(huì)引起耐藥毒株流行的公共衛(wèi)生問題。如楊洪等［7］報(bào)道2011年我國涼山州未治療人群原發(fā)耐藥率為5.43％（7/129），達(dá)到中度流行狀態(tài)。因此有效開展HIV耐藥檢測對于指導(dǎo)個(gè)體治療和防控HIV耐藥傳播都具有十分重要的意義。

2 HIV耐藥檢測方法

2.1 表型耐藥檢測

表型耐藥檢測原理是通過檢測在體外不同濃度抗病毒藥物存在情況下HIV病毒的復(fù)制能力，評(píng)價(jià)病毒對藥物的敏感性，結(jié)果以所檢毒株的50％抑制濃度（50％Inhibitory Concentration，IC50）與作為對照的野生毒株的IC50的倍數(shù)改變來表示［8］，適用于復(fù)雜多位點(diǎn)的耐藥性突變檢測，可以用于評(píng)估新的抗病毒藥物。

作為傳統(tǒng)檢測方法，外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）共培養(yǎng)法通過p24抗原定量來計(jì)算待測毒株的IC50，實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，對于技術(shù)和費(fèi)用的需求標(biāo)準(zhǔn)較高，同時(shí)在培養(yǎng)過程中存在誘導(dǎo)出耐藥優(yōu)勢株的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用具有局限性。除PMBC外，還有一些細(xì)胞系可作為指示細(xì)胞，比如穩(wěn)定表達(dá)CD4、CXCR4和CCR5受體的TZM-b1，并且TZM-b1細(xì)胞也可以被假病毒所感染［9］。以重組技術(shù)為基礎(chǔ)的假病毒表型耐藥檢測是將擴(kuò)增的HIV特定區(qū)域基因插入載體，用構(gòu)建的重組病毒進(jìn)行檢測。目前商品化的檢測試劑盒主要有：AntivirogramlTM、PhenoSense GTTM和PhenoscriptTM。假病毒表型耐藥檢測具有較高的安全性，過程相對較為快捷，能夠檢測病毒載量較低的樣本。徐萌等［10］通過構(gòu)建40株包含患者基因片段的假病毒對6組不同單藥和多藥進(jìn)行表型耐藥檢測，成功定量評(píng)估了樣本的耐藥水平，而楊婧等［11］對比研究了5種藥物的真病毒和假病毒表型耐藥檢測情況，數(shù)據(jù)表明兩種方法一致性較高，僅有對于齊多夫定的一個(gè)檢測結(jié)果存在耐藥程度的不同，其結(jié)果為假病毒表型耐藥檢測推廣應(yīng)用的適宜性提供了更多的支持。

2.2 基因型耐藥檢測

基因型耐藥檢測基于分子生物學(xué)方法，擴(kuò)增基因組中耐藥相關(guān)的特定區(qū)域目的基因片段并進(jìn)行序列測定，利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)果解釋，操作簡單，所用時(shí)間短。標(biāo)準(zhǔn)的基因型耐藥檢測的對象主要是蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域，隨著更多不同靶向藥物如整合酶抑制劑、CCR5拮抗劑等的應(yīng)用，檢測范圍也在不斷拓展［12］。Kagan等［13］在CCR5/CCR2雙重拮抗劑的臨床Ⅱ期試驗(yàn)中比較了基因型和表型耐藥檢測，發(fā)現(xiàn)二者具有較高的一致性，而基因型耐藥檢測在檢測周期和成本上具備優(yōu)勢。

常用的HIV耐藥基因型檢測商品化試劑盒有TRUGENETM和ViroSeqTM，具備對應(yīng)的耐藥數(shù)據(jù)庫，檢測成本昂貴。實(shí)驗(yàn)室自建的In-house方法一般用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果分析常用斯坦福大學(xué)耐藥數(shù)據(jù)庫（Stanford HIVdb），在常規(guī)化推廣中表現(xiàn)出更好的性價(jià)比［14］。李晶等［15］對In-house方法和TRUGENETM、ViroSeqTM兩種商品化試劑盒的檢測結(jié)果比較研究發(fā)現(xiàn)，三種方法的一致率達(dá)到99.42％（2933/2950）。病毒載量達(dá)到1000拷貝/毫升被認(rèn)為是推薦進(jìn)行耐藥檢測的閾值，但對低水平病毒血癥的患者開展耐藥檢測正在逐漸引起更多的重視。Gonzalez-Serna等［16］的研究顯示，采用實(shí)驗(yàn)室自建方法，病毒載量在50～249拷貝/毫升之間的樣本成功率為74％，大于250拷貝/毫升的成功率可以達(dá)到90％。

目前用于基因型耐藥檢測的樣本主要為抗凝全血或血漿，但對于樣本的保存運(yùn)輸條件要求較高。以濾紙作為載體的干血斑（Dried blood spots，DBS）樣本具備易采集處理、危險(xiǎn)性低、便于儲(chǔ)存運(yùn)輸、費(fèi)用低廉的優(yōu)勢，適合在資源環(huán)境條件有限的地區(qū)推廣應(yīng)用［17］。馬鵬飛等［18］研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室自建方法，36份樣本中DBS的耐藥檢測結(jié)果有31份與血漿相比完全一致（86％）。但濾紙載體樣本也存在樣本量小、對于低病毒載量的患者檢測不準(zhǔn)確等問題，WHO HIV耐藥實(shí)驗(yàn)室策略［19］中指出，干血漿斑（dried plasma spot，DPS）和干血清斑（dried serum spot，DSS）樣本不適合于耐藥監(jiān)測調(diào)查。

2.3 虛擬表型耐藥檢測

作為新型耐藥檢測方法的虛擬表型耐藥檢測在2001年由Graham等報(bào)道［20］，其原理是通過將基因型檢測結(jié)果的序列信息提交基因型-表型匹配的大容量數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)比對鑒別出與患者所帶毒株相似的基因型，評(píng)估其對應(yīng)的表型信息的平均IC50，以分析所測毒株的可能表型。Jiamsakul等［21］研究顯示，基于Stanford HIVdb的基因型和基于vircoTYPETM的虛擬表型耐藥檢測結(jié)果具有高度一致性。前文的Gonzalez-Serna等［16］也使用了虛擬表型方法進(jìn)行重復(fù)分析，獲得了非常相似的結(jié)果。虛擬表型耐藥檢測本質(zhì)上是對基因型耐藥檢測結(jié)果的二次分析，是建立在實(shí)驗(yàn)室的具體檢測結(jié)果上的一種間接性預(yù)測，與表型耐藥檢測相比檢測成本低，顯著節(jié)約工作時(shí)間，已經(jīng)在美國、歐洲等推薦使用［22］，比如McFaul等［23］用虛擬表型方法有效評(píng)價(jià)了2011～2013年在倫敦未治療HIV感染人群中的的耐藥流行情況。

3 HIV耐藥檢測的應(yīng)用

HIV耐藥檢測對于個(gè)體抗病毒治療和公共衛(wèi)生層面的艾滋病防控工作意義重大。在臨床工作中，耐藥檢測能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)生對于患者進(jìn)行科學(xué)管理，優(yōu)化治療方案，提高抗病毒治療質(zhì)量。相對應(yīng)的是在治療藥物的選擇上，具備高耐藥屏障的藥物如整合酶抑制劑度魯特韋與其他藥物的聯(lián)合使用也更加受到關(guān)注［24］。我國艾滋病診療指南［25］推薦在抗病毒治療病毒載量下降不理想或抗病毒治療失敗需要改變治療方案時(shí)，和條件允許時(shí)在抗病毒治療前，進(jìn)行HIV基因型耐藥檢測。美國成人及青少年艾滋病抗病毒治療指南［1］建議對于已知或可能存在復(fù)雜耐藥突變位點(diǎn)，特別是蛋白酶抑制劑耐藥的情況下，聯(lián)合使用表型和基因型耐藥檢測。Luz等［26］在巴西的研究指出，在抗病毒治療開始前的基因型耐藥檢測能夠延長預(yù)期壽命和節(jié)約成本，獲得更高的健康收益。

在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，開展耐藥檢測有助于研究人員掌握HIV耐藥毒株的流行狀況、傳播趨勢和變化規(guī)律，科學(xué)有效的評(píng)估和應(yīng)對HIV耐藥風(fēng)險(xiǎn)。我國自2005年開始對HIV耐藥檢測方法進(jìn)行室間平行比對，至2009年已有19個(gè)省23家省市級(jí)實(shí)驗(yàn)室參加，累計(jì)提交的95份結(jié)果顯示97.7％總序列陽性率，78.9％耐藥位點(diǎn)判讀完全一致率，76.8％序列編輯分析一致率，檢測能力和質(zhì)量總體不斷提高［27］?？紤]到直接來源于臨床樣本的考核品在安全性和穩(wěn)定性等方面要求嚴(yán)格，羅慧景等［28］提出將包含耐藥目的基因的重組質(zhì)粒作為基因型能力驗(yàn)證考核品，能夠達(dá)到反復(fù)凍融5次以上而保持穩(wěn)定性。HIV耐藥檢測是耐藥監(jiān)測工作的重要內(nèi)容，在確保耐藥檢測質(zhì)量，提升檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，將HIV耐藥檢測與流行病學(xué)調(diào)查相結(jié)合，有效分析耐藥相關(guān)影響因素，可以為完善HIV耐藥的預(yù)防和控制策略提供參考，如肖占沛等［29］對江蘇省艾滋病患者耐藥及影響因素的調(diào)查研究結(jié)果顯示，不穩(wěn)定的居住狀況和低收入水平可能作為服藥依從性的相關(guān)因素影響耐藥，提示需要對于此類型重點(diǎn)人群給予更多的關(guān)注和干預(yù)。因此，做好HIV耐藥檢測工作，能夠?yàn)榻档虷IV耐藥的發(fā)生、傳播和流行，加強(qiáng)艾滋病防治工作提供科學(xué)指導(dǎo)和支持。

［1］Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents.Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents［EB/OL］.Department of Health and Human Services，2014.http∶//aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/AdultandAdolescentGL.pdf.

［2］Pham QD，Wilson DP，Law MG，et al.Global burden of transmitted HIV drug resistance and HIV-exposure categories：a systematic review and meta-analysis［J］.AIDS，2014，28（18）：2751-2762.

［3］Pennings PS.HIV drug resistance：problems and perspectives［J］.Infect Dis Rep，2013，5（Suppl 1）：21-25.

［4］World Health Organization.The HIV drug resistance report-2012［M］.World Health Organization，2012.

［5］Cortez KJ，Maldarelli F.Clinical management of HIV drug resistance［J］.Viruses，2011，3（4）：347-378.

［6］Yao S，Yang J，Zhou L，et al.Study on HIV viral load in plasma and drug resistance among AIDS patients receiving antiretroviral treatment in Dehong prefecture，Yunnan province［J］.Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2014，35

（4）：411-416.

［7］楊洪，蘇玲，王啟興，等.涼山州部分彝族人群2011年HIV耐藥警戒線監(jiān)測研究［J］.中國艾滋病性病，2015，21（1）：28-30.

［8］Tang MW，Shafer RW.HIV-1 Antiretroviral Resistance［J］.Drugs，2012，72（9）：e1-e25.

［9］Guo W，Li H，Zhuang D，et al.Impact of Y181C and/or H221Y mutation patterns of HIV-1 reverse transcriptase on phenotypic resistance to available non-nucleoside and nucleoside inhibitors in China［J］.BMC Infect Dis，2014，14：237.

［10］徐萌，繩波，袁霖，等.新型HIV-1表型耐藥系統(tǒng)臨床檢測應(yīng)用研究［J］.中國病毒病雜志，2014，49（4）：285-292.

［11］楊婧，耿文清，張旻，等.HIV-1基因型，假病毒表型與活病毒表型耐藥檢測結(jié)果的比較［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志（電子版），2014，8（3）：308-313.

［12］Dunn DT，Coughlin K，Cane PA.Genotypic resistance testing in routine clinical care［J］.Curr Opin HIV AIDS，2011，6（4）：251-257.

［13］Kagan RM，Johnson EP，Siaw MF，et al.Comparison of genotypic and phenotypic HIV type 1 tropism assay：Results from the screening samples of Cenicriviroc Study 202，a randomized phase II trial in treatment-naive subjects［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2014，30（2）：151-159.

［14］Chaturbhuj DN，Nirmalkar AP，Paranjape RS，et al.Evaluation of a cost effective In-House method for HIV-1drug resistance genotyping using plasma samples［J］.PLoS One，2014，9（2）：e87441.

［15］李晶，蔣巖，呂超，等.三種HIV-1基因型耐藥檢測方法的一致性評(píng)價(jià)［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，47（11）：1050-1055.

［16］Gonzalez-Serna A，Min JE，Woods C，et al.Performance of HIV-1drug resistance testing at low-level viremia and its ability to predict future virologic outcomes and viral evolution in treatment-naive individuals［J］.Clin Infect Dis，2014，58（8）：1165-1173.

［17］Monleau M，Aghokeng AF，Eymard-Duvernay S，et al.Field evaluation of dried blood spots for routine HIV-1 viral load and drug resistance monitoring in patients receiving antiretroviral therapy in Africa and Asia［J］.J Clin Microbiol，2014，52（2）：578-586.

［18］馬鵬飛，邢輝，廖玲潔，等.干血斑用于HIV-1耐藥基因型檢測的研究［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44（11）：993-998.

［19］World Health Organization.WHO/HIVResNet HIV drug resistance laboratory strategy［M］.World Health Organization，2010.

［20］Graham N，Peeters M，Verbiest W，et al.The virtual phenotype is an independent predictor of clinical response［C］.Program and abstracts of the 8th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections，2001：4-8.

［21］Jiamsakul A，Kantor R，Li PC，et al.Comparison of predicted susceptibility between genotype and virtual phenotype HIV drug resistance interpretation systems among treatment-naive HIV-infected patients in Asia：TASER-M cohort analysis［J］.BMC Res Notes，2012，5：582.

［22］Lengauer T，Pfeifer N，Kaiser R.Personalized HIV therapy to control drug resistance［J］.Drug Discov Today Technol，2014，11：57-64.

［23］McFaul K，Lim C，Jones R，et al.Transmitted antiretroviral drug resistance in treatment nave HIV-infected persons in London in 2011 to 2013［J］.J Int AIDS Soc，2014，17（Suppl 3）：19747.

［24］Cruciani M，Malena M.Combination dolutegravir-abacavir-lamivudine in the management of HIV/AIDS：clinical utility and patient considerations［J］.Patient Prefer Adherence，2015，9：299-310.

［25］中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)艾滋病學(xué)組.艾滋病診療指南（2011版）［J］.中華傳染病雜志，2011，29（10）：629-640.

［26］Luz PM，Morris BL，Grinsztejn B，et al.Cost-Effectiveness of Genotype Testing for Primary Resistance in Brazil［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2015，68（2）：152-161.

［27］邢輝，廖玲潔，鐘平，等.中國2007-2009年HIV-1耐藥基因型檢測質(zhì)量評(píng)估結(jié)果［J］.中國艾滋病性病，2012，18（4）：206-209，217.

［28］羅慧景，李晶，范文成，等.HIV-1基因型耐藥檢測能力驗(yàn)證考核品的制備和評(píng)估［J］.中國病毒病雜志，2015，5（1）：22-26.

［29］肖占沛，宏雄，還錫萍，等.江蘇省艾滋病患者HIV-1耐藥株的流行及影響因素研究［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，32（9）：1314-1319.