正交試驗(yàn)優(yōu)化大葉榕果實(shí)原花青素提取工藝

張 鏡，何洪洛

（嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015）

正交試驗(yàn)優(yōu)化大葉榕果實(shí)原花青素提取工藝

張 鏡，何洪洛

（嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015）

經(jīng)過溶劑種類及體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、pH值、提取溫度等與大葉榕果實(shí)原花青素提取效果相關(guān)的單因素試驗(yàn)，再經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化得大葉榕果實(shí)原花青素的最佳提取條件。提取液以正丁醇-鹽酸法顯色，檢測(cè)546 nm波長(zhǎng)處吸光度。研究表明大葉榕原花青素提取的優(yōu)化條件是80%乙醇溶液為提取溶劑、溶液pH 3、料液比1∶15、提取時(shí)間1 h、提取溫度40 ℃，各因素對(duì)原花青素提取效果的影響大小依次為：料液比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。以正交優(yōu)化參數(shù)經(jīng)5 次重復(fù)提取得到大葉榕果實(shí)原花青素含量為13.05%，提取2 次原花青素提取率為91.46%。

大葉榕；果實(shí)；原花青素；提取工藝

原花青素是一類清除自由基、抗氧化活性很強(qiáng)的植物天然活性產(chǎn)物[1-3]，有抗腹瀉、抗?jié)?、抗疲勞、防癌抗癌、抗突變、防輻射、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)等多重療效，可預(yù)防自由基引起的心臟病、關(guān)節(jié)炎等80多種疾病[4-10]。原花青素以其高效、低毒、高生物利用率著稱，是近年來不斷研發(fā)的一種極強(qiáng)體內(nèi)活性功能因子，在保健食品、化妝品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

原花青素由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素等結(jié)合而成，最簡(jiǎn)單的原花青素是由兒茶素或表兒茶素、或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體、三聚體、四聚體乃至十聚體。通常將二至四聚體成為低聚體，五聚體以上稱為高聚體[11]。原花青素為雙黃酮衍生物的天然多酚、生物類黃酮化合物[12]，在酸性條件下加熱可降解為紅色的花青素，故稱為原花青素[13-14]。20世紀(jì)50年代法國(guó)學(xué)者首先從松樹皮中提取出原花青素，之后研究發(fā)現(xiàn)葡萄、山碴、花生、銀杏、松樹等植物中都含量豐富[15]。

榕樹是?？崎艑贌o花果類植物，為熱帶雨林中的主要樹種之一。我國(guó)榕屬植物約100 種，主要分布在福建、廣東、廣西、海南、臺(tái)灣和浙江等地。榕樹葉含三萜苷、黃酮苷、酸性樹脂、鞣質(zhì)等，其中黃酮類和萜內(nèi)酯類等有效成分對(duì)治療冠心病、老年性癡呆、腦血栓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和消除自由基、抑菌、抗癌等有顯著效果，無毒副作用，并以此開發(fā)出多種藥品和保健食品[16-17]。關(guān)于大葉榕樹的活性物質(zhì)的研究現(xiàn)僅見從大葉榕樹葉、樹須提取黃酮類物質(zhì)的報(bào)道，但尚未見有大葉榕果實(shí)活性物質(zhì)的報(bào)道。本研究?jī)?yōu)化大葉榕果實(shí)原花青素的提取工藝參數(shù)，為大葉榕原花青素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果實(shí)成熟期間從廣東省梅州市采摘淡紅色大葉榕成熟果實(shí)，剔出傷果、腐果，自來水洗去果面塵土，晾干果面余水，冷凍干燥，粉碎，過80 目篩，粉末物料5 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

無水甲醇、無水乙醇、正丁醇（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸、硫酸鐵銨（均為分析純） 廣東光華化學(xué)廠有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JLL28-B低速大容量多管離心機(jī)、GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BT2K XL凍干機(jī)美國(guó)VirTis公司；U-2800紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素提取效果的測(cè)定[18]

準(zhǔn)確稱取適量大葉榕果實(shí)物料，一定條件下浸提，提取液定容，取1 mL樣液于比色管中，依次加入6 mL正丁醇-鹽酸溶液（體積比為95∶5）和0.2 mL 2%硫酸鐵銨，搖勻后沸水浴加熱顯色，40 min后立刻取出，冰水中冷卻至室溫，測(cè)反應(yīng)液546 nm波長(zhǎng)處吸光度A546nm，按公式（1）計(jì)算各處理原花青素的得率，即處理提取的原花青素占物料的質(zhì)量百分比。

式中：A為吸光度；V為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量/mg；0.366為吸收系數(shù)。

物料總原花青素含量的測(cè)定：稱取物料0.500 g，以提取各因素的正交優(yōu)化參數(shù)及pH 3條件下重復(fù)提取物料的原花青素5 次，合并提取液，測(cè)定提取液A546nm，按公式（2）計(jì)算得物料原花青素提取率。

式中：q為各處理原花青素的得率/%；p為物料中總原花青素的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)/%。

1.3.2 提取溶劑的篩選

準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，以料液比1∶10（g/mL）分別加入70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮、水及乙酸乙酯，30 ℃浸提1 h，4 500 r/min離心20 min，取0.2 mL上清液，定容到5 mL，同1.3.1節(jié)顯色，測(cè)定A546nm。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，按料液比1∶10（g/mL）加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液，自然pH值（提取溶液未加酸、堿進(jìn)行pH值調(diào)整），30 ℃浸提1 h，4 500 r/min離心20 min，取0.2 mL上清液定容到5 mL，同

1.3.1 節(jié)顯色，測(cè)定A546nm。

1.3.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，自然pH值，在料液比1∶10、溫度30 ℃條件下分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5、3h，4 500 r/min離心20 min，取0.2 mL上清液定容到5 mL，同1.3.1節(jié)顯色，測(cè)定A546nm。

1.3.3.3 料液比對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，料液比分別為1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5（g/mL），自然pH值，30 ℃浸提1 h，4 500 r/min離心20 min，上清液定容到5 mL，同1.3.1節(jié)顯色，測(cè)定A546nm。

1.3.3.4 pH值對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，分別加入pH值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在料液比1∶10、30℃條件下浸提1 h，4 500 r/min離心20 min，取0.2 mL上清液定容到5 mL，同1.3.1節(jié)顯色，測(cè)定A546nm。

1.3.3.5 提取溫度對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，加入自然pH值的70%乙醇溶液，料液比1∶10，設(shè)定溫度浸提1 h，4 500 r/min離心20 min，取0.2 mL上清液定容到5 mL，同1.3.1節(jié)顯色，測(cè)定A546nm。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，pH 3，按正交試驗(yàn)因素組合浸提后，4 500 r/min離心20 min，上清液定容到5 mL，同1.3.1節(jié)顯色，測(cè)定A546nm。

1.3.5 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取大葉榕果實(shí)物料0.500 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇（pH 3）在料液比1∶10、溫度30 ℃條件下，浸提1 h，4 500 r/min離心20min，取0.2 mL上清液定容到5 mL，同1.3.1節(jié)顯色，測(cè)定A546nm，重復(fù)提取5 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各處理均設(shè)3 次重復(fù)取平均值，以SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行差異顯著性測(cè)定，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著，以不同小寫字母表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的篩選

圖 1 不同溶劑對(duì)大葉榕原花青素的提取效果Fig.1 Effect of solvent type on the extraction effi ciency of proanthocyanidins

由圖1可知，不同溶劑對(duì)大葉榕果實(shí)原花青素的提取效果差異明顯，丙酮溶液的效果最佳，甲醇、乙醇次之，乙酸乙酯的提取效果最差。丙酮的羰基氧可作為強(qiáng)的氫鍵受體，能在葡萄糖上將結(jié)合的多聚體酚類取代。因甲醇、丙酮的毒性比較高，提取物若去除不完全則存在安全性問題，而乙醇廣泛應(yīng)用于活性成分的提取，安全性高。另外，植物中的原花青素在花、葉、果等組織中，多以糖苷或有機(jī)酸的形式存在，而在木部堅(jiān)硬組織中，則多以游離苷元形式存在。乙醇一方面易將糖苷轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂尚问?。另一方面，其極性對(duì)提取苷元結(jié)構(gòu)物質(zhì)十分有利。因此以乙醇為提取溶劑更適用。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

圖 2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction effi ciency of proanthocyanidins

由圖2可知，以乙醇為提取溶劑，體積分?jǐn)?shù)在30%～80%范圍內(nèi)，提取液的吸光度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，80%乙醇溶液的提取效果最好。90%乙醇的提取效果比80%溶液的提取效果差，但差異不顯著，無水乙醇原花青素的提取效果最差。原花青素含有多羥基，乙醇含有羥基，易于原花青素的羥基以氫鍵形式結(jié)合，在水溶液中兩者氫鍵結(jié)合作用較強(qiáng)，80%、90%乙醇溶液的提取效果好，但無水乙醇的提取效果很差。

2.3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

圖 3 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction effi ciency of proanthocyanidins

從圖3可見，提取初期隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，原花青素得率逐漸增加，浸提1.5 h時(shí)大葉榕果實(shí)物料內(nèi)原花青素的溶出量最大，提取效果最好，較1 h提取的效果差異極顯著（P＜0.01）。之后再延長(zhǎng)提取時(shí)間，原花青素得率不僅無明顯提高，反而略有下降，但差異不顯著。

2.4 料液比對(duì)提取效果的影響

圖 4 料液比對(duì)原花青素提取效果的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on the effi ciency of proanthocyanidins

大葉榕果實(shí)物料分別與70%乙醇溶液以不同的料液比混合，30℃提取1h。由圖4可以看出，隨著溶劑用量的增加，原花青素得率亦增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶17.5時(shí)，原花青素的提取效果最好，而料液比達(dá)1∶20時(shí)，原花青素得率反而有所降低。這可能是因?yàn)槿軇┯昧窟^大溶解出了較多雜質(zhì)，影響了原花青素的提取。料液比1∶15的得率8.46%，較溶劑用量較小樣品差異顯著（P＜0.05）再提高溶劑用量原花青素的提取效果沒有明顯提高。溶劑用量越大提取效率越高，但溶劑的用量增大，提取液后續(xù)的溶劑回收、精制、干燥的費(fèi)用增大，因此選擇1∶15為最佳料液比。

2.5 pH值對(duì)提取效果的影響

由圖5可以看出，在pH值為3時(shí)原花青素的提取效果最好，當(dāng)pH值在3～6范圍內(nèi)，原花青素得率隨提取pH值的升高而略有降低，在pH值大于6的條件下原花青素得率明顯降低。結(jié)果表明弱酸性條件下有利于大葉榕原花青素的提取，但是酸性過強(qiáng)，則不利于原花青素的提取，因此適度選擇酸化的乙醇有利于原花青素的提取，選擇pH 3為最佳提取pH值。

圖 5 pH值對(duì)原花青素提取效果的影響Fig.5 Effect of solvent pH on the extraction effi ciency of proanthocyanidins

2.6 提取溫度對(duì)原花青素提取效果的影響

圖 6 提取溫度對(duì)原花青素提取效果的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the extraction effi ciency of proanthocyanidins

圖6 為大葉榕果實(shí)物料0.500 g樣品在不同溫度、提取時(shí)間1 h條件下的原花青素提取結(jié)果。由圖6看出，隨著溫度的上升，原花青素得率逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，原花青素提取效果最佳。溫度高于50 ℃時(shí)，原花青素得率逐漸下降。因溫度較低時(shí)原花青素與蛋白質(zhì)、纖維素等結(jié)合物分離較慢，原花青素溶出量較少，提取率相對(duì)較低。在較高溫度條件下，分子運(yùn)動(dòng)速度及滲透、擴(kuò)散及溶解速度加快，原花青素的溶出量大、提取率提高；但若溫度過高，原花青素容易氧化、聚合、結(jié)構(gòu)易破壞，提取率降低，因此選擇50 ℃為佳。

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)，對(duì)大葉榕原花青素提取的溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4 個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，因單因素試驗(yàn)料液比1∶15的結(jié)果最佳，且溶劑用量更小的3 個(gè)處理的提取效果均與此無顯著差異（P＞0.05），若再增大溶劑的用量不利于提取液后續(xù)的濃縮、干燥，故正交試驗(yàn)料液比的水平設(shè)置及0.500 0 g大葉榕果實(shí)物料原花青素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表 1 大葉榕果果實(shí)原花青素提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design arrangement and corresponding results

由表1可知，料液比（D）的極差最大，對(duì)物料中原花青素提取效果的影響最大，其第3水平的值最大，即料液比1∶15的效果最好。提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的極差僅次于料液比，分別以第1水平和第3水平為最佳。正交試驗(yàn)結(jié)果表明各因素對(duì)原花青素提取效果的影響按大小排列分別為D＞A＞C＞B，在試驗(yàn)范圍內(nèi)最好效果的提取參數(shù)為A1B1C3D3，即80%乙醇溶液為提取溶劑、料液比1∶15、提取時(shí)間1 h及提取溫度40 ℃。

2.8 提取次數(shù)的確定

表 2 不同提取次數(shù)條件下原花青素的提取效果Table 2 Effects of extraction number on the extraction rate of procyanidins

由表2看出，隨著提取次數(shù)的增加，原花青素的累積提取率隨之提高，重復(fù)提取2 次時(shí)原花青素的累積提取率為91.46%，重復(fù)提取3 次為97.10%，僅較提取2 次的提取率高5.64%。結(jié)果表明經(jīng)2 次提取原花青素大部分已從物料溶出，因此物料原花青素以正交優(yōu)化的參數(shù)提取2 次即可。

3 結(jié) 論

經(jīng)單因素試驗(yàn)與正交優(yōu)化獲得了大葉榕果實(shí)原80 目過篩的粉末浸取花青素的最佳工藝條件：以80%乙醇溶液提取溶劑（pH 3）、料液比1∶15、提取時(shí)間1 h、提取溫度40 ℃，大葉榕果實(shí)原原花青素以優(yōu)化提取參數(shù)經(jīng)2次提取原花青素的提取率達(dá)到91.46%。

水果中原花青素的含量豐富，如新疆的葡萄為8.17%、歐洲李為7.61%、沙棗為6.71%、櫻桃李為3.69%（均為干果）[19-20]，但迄今少見有水果中原花青素的含量有超過10%的報(bào)道。而除水果外的其他植物材料中原花青素的含量更低，如高粱原花青素含量1.11%～4.10%[21]、柳樹葉原花青素含量為3.17%[22]、青海蠶豆的原花青素含量約2.60%[23]。本研究對(duì)大葉榕果實(shí)原花青素經(jīng)反復(fù)5 次提取的累積得率（即大葉榕果實(shí)原花青素的含量）高達(dá)13.05%，已有文獻(xiàn)少見有植物材料中原花青素含量與此相當(dāng)?shù)膱?bào)道，大葉榕不僅果實(shí)原花青素含量高，而且大葉榕樹的結(jié)果量大。大葉榕樹葉及樹須含三萜苷、黃酮苷等多種具有醫(yī)療保健功能的生物活性物質(zhì)[16-17]，因而在我國(guó)大葉榕生態(tài)適宜區(qū)規(guī)模發(fā)展大葉榕樹，不僅具有突出的生態(tài)效益，而且如若將廢棄的果實(shí)、樹葉及樹須等收集開發(fā)活性物質(zhì)，具有很大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。

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Extraction of Procyanidins from Ficus altissima Fruits

ZHANG Jing, HE Hongluo
(School of Life Science, Jiaying University, Meizhou 514015, China)

This study was carried out with a view of determining the optimal conditions for extracting proanthocyanidins from F. altissima fruits by combined use of single factor and orthogonal array designs. The effects of solvent type and concentration, extraction time, solid/liquid ratio, pH and temperature on the extraction rate of proanthocyanidins were investigated. The extracted proanthocyanidins were assayed by colorimetry using n-butanol:hydrochloric acid at a wavelength of 546 nm. The results showed that the optimal extraction conditions were found to be extraction at 40 ℃for 1 h using 80% ethanol acidified to pH 3 with a solid/liquid ratio of 1:15, and the effect of four important variables on the extraction rate of proanthocyanidins followed the decreasing order: solid/liquid ratio ＞ extraction temperature ＞ethanol concentration ＞ extraction duration. By repeating the optimized extraction procedure five times, the content of proanthocyanidins in F. altissima fruit was measured to be 13.05% and the extraction rate of procyanidins was 91.46% after the second extraction.

Ficus altissima; fruit; proanthocyanidins; extraction

TS201.1

A

1002-6630（2015）02-0041-05

10.7506/spkx1002-6630-201502008

2014-06-28

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009B011300015）

張鏡（1957 —），男，教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與應(yīng)用微生物。E-mail：zhangcqf@jyu.edu.cn