短波紫外線照射對蘋果采后灰霉病抗性誘導(dǎo)作用

張曉曉，周會玲*，田 蓉，周曉婉，樊 勝

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

短波紫外線照射對蘋果采后灰霉病抗性誘導(dǎo)作用

張曉曉，周會玲*，田 蓉，周曉婉，樊 勝

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

為探究短波紫外線（ultraviolet C，UV-C）照射對蘋果采后灰霉病的防治效果與抗性誘導(dǎo)機理，以紅富士蘋果為材料，采用劑量分別為3.5、7.0、10.5 kJ/m2的UV-C（280 nm）進行照射，常溫條件下放置2 d 后接種灰葡萄孢菌，以不經(jīng)UV-C照射直接接種灰葡萄孢菌的果實作為對照。結(jié)果表明：照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2的UV-C照射可顯著降低果實灰霉病的發(fā)生率，抑制病斑直徑的擴展（P＜0.01），其中照射劑量為7.0 kJ/m2UV-C處理的效果更好；而照射劑量為10.5 kJ/m2的UV-C照射處理在接種后貯藏前期對病害有抑制作用，后期卻加快病害發(fā)展。3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理能誘導(dǎo)蘋果果實幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等抵御酶活性的提高，誘導(dǎo)酚類物質(zhì)的合成，進而增強果實的抗病性，其中7.0 kJ/m2UV-C處理誘導(dǎo)效果更明顯，與對照差異顯著（P＜0.01）。10.5 kJ/m2UV-C照射僅在接種后前期誘導(dǎo)POD、PPO、PAL和幾丁質(zhì)酶的活性迅速上升，提高總酚和類黃酮含量，但對β-1,3-葡聚糖酶活性沒有誘導(dǎo)作用。

蘋果；灰霉；UV-C照射；防治效果；誘導(dǎo)機理；防御酶活性

由病原菌引起的腐爛是造成蘋果采后損失的主要原因?；颐共∽鳛樘O果采后主要侵染性病害，其致病途徑通常有兩種：首先是傷口侵染；其次是花期侵染，潛伏到貯藏4～5 個月后發(fā)病[1]。蘋果在采摘、運輸和貯藏過程中易遭受機械損傷，這為病原菌的侵入提供了便利條件。致病菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers）具有很強的耐低溫能力，即使在冷藏條件下也可導(dǎo)致蘋果腐爛。而且果實一旦發(fā)病，病斑會很快擴及全果，造成嚴(yán)重?fù)p失。因此，探究安全有效的防治措施意義重大。目前對蘋果采后侵染性病害的防治多以化學(xué)防腐為主，但是因其高殘留、毒性大、環(huán)境污染及病原菌產(chǎn)生抗藥性等諸多弊端而被限制使用。

近年來，短波紫外線（ultraviolet C，UV-C）照射作為一種物理防治手段在控制果蔬腐爛[2-3]、誘導(dǎo)抗病性[4-7]、延緩成熟[8-10]方面表現(xiàn)出較好的效果，又因其具有技術(shù)操作簡單、能源消耗少[11]、無殘留、不產(chǎn)生有害物質(zhì)[12]等優(yōu)點，已作為一種潛在的環(huán)保型果蔬貯藏手段受到人們的關(guān)注[13-14]。目前，人們已在番茄[15-17]、甜瓜[18]、藍莓[19-20]、香菇[21]、酸橙[22]、香蕉[23]、草莓[24]、桃[25]、辣椒[26]、蘆柑[27]等多種果蔬上進行了UV-C防腐保鮮研究，并取得了一系列成果。

在蘋果上，利用UV-C照射控制采后腐爛與病害防治的研究也已見報道。Stevens等[28]早在1996年指出，UV-C照射能夠有效控制蘋果果實黑斑病和苦痘病的發(fā)生。Wilson等[29]用UV-C照射‘Empire’（帝國）蘋果發(fā)現(xiàn)，UV-C照射大大降低了果實腐爛率，貯藏28 d處理組腐爛率較對照降低了52%。de Capdeville等[30]對比了UV-C照射、酵母菌生防、殼聚糖處理對蘋果青霉的防治效果，結(jié)果顯示3 種處理均能有效控制病害發(fā)生，且紫外線照射的防治效果最顯著，但處理間不存在協(xié)同作用。吳芳芳等[31]研究認(rèn)為，UV-C照射結(jié)合低溫處理能夠明顯降低蘋果采后炭疽病發(fā)病率，減輕發(fā)病指數(shù)。目前，UV-C在蘋果采后灰霉病防治方面未見報道，對其防治效果和機理有待深入研究。

本實驗旨在采用不同劑量UV-C照射蘋果果實，接種灰葡萄孢子懸浮液后觀察灰霉病發(fā)病情況，研究UV-C處理對蘋果采后灰霉病的防治效果；并通過分析抗性相關(guān)酶活性及抗性物質(zhì)含量變化，探討UV-C照射對蘋果采后灰霉病的誘導(dǎo)抗性機理，為UV-C在蘋果采后灰霉病防治方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紅富士蘋果（Malus domestica cv.‘Fuji’）采于管理規(guī)范的陜西省楊凌果園，當(dāng)天運回實驗室。預(yù)冷一晚后選擇大小均勻一致，色澤相近，果形端正，無機械損傷和病蟲害的生理成熟期果實作為實驗用果。

灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers）來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-LB型無菌操作臺 蘇凈集團安泰公司；ULTRAVIOLET-C 30W/G30 T8紫外燈 荷蘭Philips公司；ZQJ-254型紫外線強度計 上海寶山顧村電光儀器廠；BCD-236DT型冰箱 青島海爾股份有限公司；AUY220分析天平 日本島津公司；3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；HHS 21-4電熱恒溫水浴鍋北京長安科學(xué)儀器廠；UV-1800型紫外-可見分光光度計科大中佳公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌孢子懸浮液的制備

將灰葡萄孢接種于PDA培養(yǎng)基上，23 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)5 d。然后用體積分?jǐn)?shù)為0.05%的Tween 80無菌水沖洗平板，采用血球計數(shù)板法制成濃度約為1×107個/mL的孢子懸浮液。

1.3.2 樣品處理

用清水沖洗供試蘋果，晾干后分別進行3.5、7.0、10.5 kJ/m2的UV-C照射處理。紫外燈管平行放置，間距為10 cm，與臺面的垂直距離為40 cm，用紫外線強度計測得蘋果放置處的照射強度為1.2 W/m2。依據(jù)照射劑量的不同確定各處理的照射時間，以不經(jīng)UV-C照射處理的果實作為對照。為確保果實均勻受光，照射前在臺面上鋪一層錫箔紙，照射半程時上下翻轉(zhuǎn)果實。

處理組與對照組均于室溫（20±1）℃條件下放置2 d后進行接種實驗。接種前用75%的酒精對果實進行表面消毒，晾干后用直徑3 mm已滅菌的不銹鋼釘子在蘋果赤道部位均勻刺入3 個傷口（深4 mm，寬3 mm），待傷口表面晾干后分別接種20 μL 1×107個/mL 灰霉孢子懸浮液。菌液充分吸收后裝入聚乙烯袋中平鋪于桌面上（果蒂向上，果實間留有2 cm左右縫隙），果實在20 ℃恒溫放置（袋內(nèi)相對空氣濕度為80%～85%）。接種后每天統(tǒng)計果實發(fā)病率，測量病斑直徑，取病斑周圍健康帶皮果肉組織（直徑1.5 cm、厚度2.0 cm），液氮速凍后放于超低溫冰箱中用于測定相關(guān)活性指標(biāo)。每處理設(shè)60 個果實，重復(fù)3 次。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 發(fā)病統(tǒng)計

發(fā)病率為發(fā)病傷口數(shù)與總傷口數(shù)的比值；病斑直徑：用游標(biāo)卡尺進行十字交叉法測定，3 次測量取平均值作為每個病斑直徑的測量值，以發(fā)病傷口處病斑直徑的平均值作為各處理的病斑直徑值。

1.3.3.2 幾丁質(zhì)酶活性測定

參考袁仲玉等[32]方法，稱取1 g左右果肉，加入5 mL、pH 5.0、0.1 mol/L的醋酸緩沖液（含1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和5 mmol/L β-巰基乙醇）冰浴研磨呈勻漿后，在4 ℃、12 000×g離心30 min，取上清液提取液來測定酶活性。取0.5 mL粗酶提取液與0.3 mL 10 g/L的膠狀幾丁質(zhì)懸浮液混合，在37 ℃保溫1 h后加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的脫鹽蝸牛酶，繼續(xù)在37 ℃保溫1 h，使生成N-乙酰葡萄糖胺（Glc-NAc）單體。然后加入0.2 mL 0.6 mol/L的四硼酸鉀溶液，沸水浴5 min迅速冷卻。再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%二甲基胺硼烷溶液，在37 ℃溫水中保溫10 min 顯色，最后在585 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度。用煮沸5 min的酶液作對照，計算Glc-NAc的生成量。以每分鐘每克蛋白分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生的1×10—9mol Glc-NAc為1個酶活力單位，即U/（min·g）。重復(fù)3 次。

1.3.3.3 β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活性測定

粗酶提取液制備方法同1.3.3.2節(jié)，采用蒽酮法測定620 nm波長處的OD值，計算糖的生成量。以單位時間單位質(zhì)量果肉催化底物產(chǎn)生1 nmol的葡萄糖為1個酶活單位（U/g）。重復(fù)3 次。

1.3.3.4 過氧化物酶（peroxldase，POD）和多酚氧化酶（polyphenoloxldase，PPO）活性測定

POD活性測定參考文獻[33]的方法，酶活性單位（U）為質(zhì)量為1 g的鮮樣果肉每分鐘吸光度的變化值，即U/（min·g）。

PPO活性測定參照文獻[34]的方法，稱取1.0 g左右果肉置于研缽中，加入5.0 mL pH值為6.0 的磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿后于4 ℃、12 000×g離心30 min。然后取2 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0），先加1 mL 0.05 mol/L鄰苯二酚，再加入0.5 mL粗酶提取液。反應(yīng)體系混勻后立即在420 nm波長處測定OD 值。以1 g的鮮樣果肉每分鐘吸光度的變化值作為1個酶活單位。即PPO 活性/（U/（min·g））=ΣΔA/t，ΔA代表吸光度的變化；t代表反應(yīng)的時間/min。3 次重復(fù)。

1.3.3.5 苯丙氨酸解氨酶（phenylalane ammonlalyase，PAL）活性測定

取1 g左右的果肉樣品，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷后的0.1 mol/L、pH值為8.8的硼酸緩沖液（含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%聚乙烯吡咯烷酮，2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和5 mmol/L β-巰基乙醇）冰浴研磨，呈漿狀后離心30 min（4 ℃、12 000×g）。參考Assis等[35]方法，取0.5 mL粗酶提取液加入3 mL 50 mmol/L、pH值為8.8 硼酸緩沖液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸混勻，于37 ℃溫水中保溫60 min使反應(yīng)生成反式肉桂酸。290 nm波長處測定混合液在保溫前后的吸光度。PAL活性（U）用每分鐘每克蛋白生成反式肉桂酸的量來表示。重復(fù)3 次。

1.3.3.6 總酚、類黃酮含量測定

稱取1g左右果肉樣品，加入5 mL的體積分?jǐn)?shù)為1% HCl-甲醇溶液，冰浴研磨勻漿，4℃提取1 h 后離心30 min（4 ℃、12 000×g）。參考文獻[36-37]方法，以沒食子酸計算總酚含量，以蘆丁計算類黃酮含量。重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和SAS 8.2軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-C照射對接種蘋果采后灰霉病的防制效果

圖 1 UV-C照射對蘋果采后灰霉病發(fā)病率（a）和病斑直徑（b）的影響Fig.1 Effects of UV-C treatments on the infection rate and diameter of disease spot of Botrytis cinerea of apple fruit

接種灰葡萄孢后，果實發(fā)病率迅速增加，1 d后對照組發(fā)病率達到44.36%，2 d后近80%傷口發(fā)病，第3 天發(fā)病率高達95%以上并趨于穩(wěn)定。UV-C照射可以明顯影響果實發(fā)病率，不同照射劑量對灰霉病作用效果不同。如圖1a所示，3.5 kJ/m2與7.0 kJ/m2UV-C照射能夠顯著降低蘋果發(fā)病率（P＜0.01），且7.0 kJ/m2UV-C照射對發(fā)病率的抑制效果更好。接種灰葡萄孢后，3.5 kJ/m2與7.0 kJ/m2UV-C處理發(fā)病率均始終低于對照，最后分別有79.5%和64.4% 的傷口發(fā)病，較對照降低了16.9%和32.7%。而10.5 kJ/m2UV-C照射在接種后2 d 內(nèi)抑制發(fā)病作用效果最明顯，此后發(fā)病率迅速上升，接種5 d后甚至超過對照，最終卻加重灰霉病的發(fā)生。

隨著貯藏時間的延長，灰霉病斑不斷擴大，但適宜劑量UV-C照射能夠有效抑制病斑的擴展。如圖1b所示，3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理組的病斑直徑始終小于對照，且差異達到顯著水平（P＜0.01），其中7.0 kJ/m2劑量UV-C處理對灰霉病斑的抑制作用最好。接種5 d 后對照組病斑直徑即擴展到20.66 mm，而3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理的僅為16.84 mm和12.98 mm，兩種劑量UV-C照射大大降低了灰霉病斑的擴展速度。10.5 kJ/m2UV-C處理在貯藏前4 d對灰霉病斑具有一定的抑制作用，但此后病斑擴展迅速，5 d后高于對照，接種后期反而加快病斑擴大。

因此，適宜劑量UV-C照射能夠有效抑制蘋果采后灰霉病，其中照射劑量為7.0 kJ/m2的UV-C照射處理效果最好，3.5 kJ/m2UV-C照射次之。照射劑量為10.5 kJ/m2UV-C處理僅在接種后貯藏前期對灰霉病有一定的抑制作用，后期反而加快灰霉的發(fā)生。

2.2 UV-C照射對接種蘋果幾丁質(zhì)酶和GLU活性的影響

圖 2 不同劑量UV-C照射處理對蘋果果實幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.2 Effects of different doses of UV-C treatment on CHI activity of‘Red Fuji’ apple fruit

接種灰葡萄孢后，幾丁質(zhì)酶活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，UV-C照射能誘導(dǎo)蘋果果實幾丁質(zhì)酶活性的提高，但不同劑量的誘導(dǎo)效果不同。如圖2所示，照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理果實的幾丁質(zhì)酶活性在整個觀察期均高于對照，且差異達到極顯著水平（P＜0.01），其中照射劑量為7.0 kJ/m2UV-C照射處理的誘導(dǎo)效果更明顯。10.5 kJ/m2UV-C照射處理果實的幾丁質(zhì)酶活性在接種后3 d內(nèi)顯著高于其他組，到第3天即達到峰值，較對照提前2 d，隨后活性持續(xù)降低，接種6 d后低于對照。而7.0 kJ/m2UV-C處理果實的幾丁質(zhì)酶的活性在接種后期仍保持較高水平。因此，照射劑量為7.0 kJ/m2UV-C處理對接種蘋果幾丁質(zhì)酶活性的誘導(dǎo)效果最好。

圖 3 不同劑量UV-C照射處理對蘋果果實GLU活性的影響Fig.3 Effects of different doses of UV-C treatment on β-1,3-glucanase activity of ‘Red Fuji’ apple fruit

不同劑量UV-C照射處理在接種后貯藏前期對蘋果果實GLU活性的誘導(dǎo)作用均不顯著，而照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理卻能誘導(dǎo)該GLU活性在接種后期大幅度升高。如圖3所示，在接菌后的前4 d GLU活性略有上升，且各組間無顯著差異，但4 d以后照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理組GLU活性開始迅速升高，到第6天達到最大值，較對照最大值分別增加了151.2% 和241.9%，此后活性略有下降，但仍顯著高于照（P＜0.01）。而10.5 kJ/m2UV-C處理組GLU活性僅在接種后前2 d略高于對照，此后與對照組保持基本一致，無顯著差異（P＜0.01）。

2.3 UV-C照射處理對接種蘋果POD、PPO和PAL活性的影響

圖 4 UV-CUV-C照射對接種蘋果果實POD活性的影響Fig.4 Effects of UV-C treatments on POD activity of inoculated apple fruit

不同處理對POD的活性變化測定結(jié)果表明，POD活性整體上均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且UV-C照射處理對接種蘋果的POD活性具有一定的誘導(dǎo)作用。如圖4所示，處理組POD活性的初始值均顯著高于對照組（P＜0.01），照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理的POD活性在整個觀察期均高于對照，且高峰出現(xiàn)時間與對照一致，都在接種后第5天達到最大值，較對照分別提高了30.6%和95.9%。照射劑量為10.5 kJ/m2UV-C處理的POD活性在接種后前2 d高于其他組，活性高峰提前1 d出現(xiàn)，此后活性迅速下降，6 d后低于對照。所以，7.0 kJ/m2UV-C照射處理能夠誘導(dǎo)蘋果果實POD活性在接種后始終保持較高的水平，3.5 kJ/m2UV-C處理的誘導(dǎo)效果次之，而照射劑量為10.5 kJ/m2UV-C處理僅能在接種后貯藏前期誘導(dǎo)POD活性提高。

圖 5 UV-CUV-C照射對接種蘋果果實PPO活性的影響Fig.5 Effects of UV-C treatments on PPO activity of inoculated apple fruit

PPO的活性變化結(jié)果表明，適宜劑量UV-C照射處理能提高果實PPO活性。如圖5所示，處理組與對照組PPO活性的變化趨勢均為先上升后下降，照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理的POD活性始終高于對照，且差異顯著（P＜0.01），其中7.0 kJ/m2UV-C處理的POD 活性高于3.5 kJ/m2UV-C處理的。照射劑量為10.5 kJ/m2UV-C處理組PPO活性的初始值顯著高于其他組（P＜0.01），并在接種后1 d活性急劇上升，此后活性略有下降，到第4天再次出現(xiàn)高峰，之后活性迅速下降，6 d后低于對照。所以，3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C照射能夠誘導(dǎo)蘋果果實的POD活性顯著提高，并能在接種后一直保持較高水平，且7.0 kJ/m2照射劑量UV-C照射的誘導(dǎo)效果更為顯著（P＜0.01）。

圖 6 UV-CUV-C照射對接種蘋果果實PAL活性的影響Fig.6 Effects of UV-C treatments on PAL activity of inoculated apple fruit

蘋果果實PAL的活性可被適宜劑量的UV-C照射誘導(dǎo)增大。如圖6所示，各處理組與對照組的PAL活性隨著病害的發(fā)展總體上均呈先上升隨后下降的趨勢。經(jīng)照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C照射處理的果實其PAL活性在接種后始終高于對照，并與對照達到極顯著差異水平（P＜0.01），其中7.0 kJ/m2UV-C處理果實的PAL活性高于3.5 kJ/m2UV-C處理。照射劑量為3.5 kJ/m2UV-C處理與對照的PAL活性均在第5天達到最大值。而照射劑量為7.0 kJ/m2和10.5 kJ/m2UV-C處理果實的PAL活性均在接種后前2 d迅速上升，此后略有下降再升高，分別到第4天和6天達到最大值，較對照分別提前1 d和推遲1 d。由圖6可以看出，照射劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理組的PAL活性在接種后期仍保持較高水平，但照射劑量為10.5 kJ/m2UV-C處理的PAL活性在5 d以后顯著低于對照（P＜0.05）。因此，3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C照射能夠誘導(dǎo)果實中PAL活性顯著提高，并使其始終保持在較高水平，且7.0 kJ/m2UV-C照射的誘導(dǎo)效果更好。

2.4 UV-C 照射處理對接種蘋果總酚含量和類黃酮含量的影響

如圖7a所示，接種后處理組和對照組的總酚含量都開始上升，且前2 d增加迅速，隨后3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理組的總酚含量繼續(xù)緩慢增加，且在接種后一直顯著高于對照（P＜0.01），其中7.0 kJ/m2UV-C 處理組的總酚含量最高。對照組和3.5 kJ/m2UV-C處理組的總酚含量均在第6天達到最大值，而照射劑量為7.0 kJ/m2UV-C處理組提前1 d達到最大值。照射劑量為10.5 kJ/m2UV-C處理組的總酚含量在接種2 d 內(nèi)顯著高于其他組（P＜0.01），此后含量迅速降低，5 d時總酚含量略微增加后又持續(xù)下降，接種6 d后低于對照。因此，3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2劑量UV-C照射處理能夠提高誘導(dǎo)蘋果果實酚類物質(zhì)的合成，且7.0 kJ/m2劑量UV-C處理的誘導(dǎo)效果更顯著；而10.5 kJ/m2UV-C處理僅在接種后貯藏前期誘導(dǎo)酚類物質(zhì)的合成，后期總酚含量甚至低于對照。

圖 7 UV-CUV-C照射對接種蘋果果實總酚（a）和類黃酮（b）含量的影響Fig.7 Effects of UV-C treatments on total phenols content and fl avonoid content of inoculated apple fruit

蘋果果實接種后類黃酮含量均呈先增加后減少的趨勢，適宜劑量UV-C照射對類黃酮的合成具有顯著的促進作用。如圖7b所示，3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2UV-C處理組的類黃酮含量在接種后均始終高于對照，且與對照差異顯著（P＜0.01），其中照射劑量為7.0 kJ/m2UV-C處理組的類黃酮含量最高。照射劑量為10.5 kJ/m2UV-C處理的類黃酮含量在接種后2 d內(nèi)顯著高于其他（P＜0.01），達到最此后持續(xù)下降，接種5 d 后低于對照，但差異不顯著（P＜0.05）。所以，劑量為3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2的UV-C處理對蘋果果實中類黃酮的合成具有明顯的促進作用，能夠誘導(dǎo)類黃酮含量處于較高水平，且7.0 kJ/m2UV-C照射的誘導(dǎo)作用強于3.5 kJ/m2UV-C處理。

3 討 論

3.1 UV-C照射處理對蘋果采后灰霉病的防治效果

低劑量的UV-C照射對果蔬采后病害的發(fā)生具有一定的防治作用，能有效抑制采后腐爛。Romanazzi等[38]的研究表明，用3.6 kJ/m2UV-C照射處理‘Autumn Black’和‘B36-55’兩個葡萄品種，貯藏1周后發(fā)病率較對照分別降低了36.4%和28.3%左右，與對照差異顯著。Vicente等[2]發(fā)現(xiàn)，辣椒在冷藏10 d后，7 kJ/m2UV-C處理組無真菌侵染，而對照組的發(fā)病率卻高達40%。此外，低劑量UV-C照射在番茄、桃、梨、香蕉、韭菜等多種果蔬的延長保鮮，提高貯藏品質(zhì)上也表現(xiàn)出較好的效果。

本研究結(jié)果顯示，3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2劑量UV-C照射處理均能有效抑制蘋果采后灰霉病，且與對照差異顯著（P＜0.01），其中7.0 kJ/m2劑量UV-C照射效果最為理想；10.5 kJ/m2劑量UV-C照射處理的蘋果在接菌后前3 d發(fā)病率與病斑直徑均低于對照，但之后發(fā)病率急劇上升，病斑迅速擴展，到第5天時發(fā)病率與病斑直徑均高于對照。因此，低劑量UV-C照射可以有效抑制蘋果采后灰霉病的發(fā)生與擴展，并且在適宜照射劑量范圍內(nèi)，劑量越高，防治效果越好，這與前人研究[31]一致。吳芳芳等[31]的研究顯示，適宜劑量的UV-C照射可抑制蘋果采后炭疽病的發(fā)生，但抑制效果并不隨著照射劑量的增加而增強，當(dāng)使用大于10.5 kJ/m2照射劑量UV-C 照射時蘋果果實表面出現(xiàn)褐斑腐爛，對果實造成傷害。本研究中，經(jīng)10.5 kJ/m2UV-C照射的蘋果在接種灰葡萄孢后前期發(fā)病較輕，這可能是UV-C照射誘導(dǎo)果實產(chǎn)生抗性引起的；后期發(fā)病嚴(yán)重發(fā)病率與病斑直徑甚至高于對照，可能因為高劑量UV-C照射對果實造成了傷害，且前期產(chǎn)生的抗性不能消除這種傷害。

3.2 UV-C照射誘導(dǎo)果實抗病性

低劑量的UV-C照射不僅可以直接殺死果蔬表面的病菌，更重要的是可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病機制，增強果蔬的抗病性。Shama等[39]提出，興奮效應(yīng)即用低劑量的潛在有害因素去誘導(dǎo)生命體產(chǎn)生脅迫反應(yīng)。UV-C照射作為一種果蔬貯藏保鮮方法，其根本原理就是利用興奮劑量的UV-C去誘導(dǎo)新鮮果蔬產(chǎn)生有益反應(yīng)[40]。UV-C照射對果蔬的有益作用主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來抵抗采后病害[41]和延遲成熟衰老保持品質(zhì)[42-44]兩個方面。

UV-C照射能夠提高果實抗病性，其機制主要是誘導(dǎo)抗性酶活性的提高，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，從而抑制病菌的侵染，控制病害發(fā)展。幾丁質(zhì)酶和GLU能破壞病原菌的細胞壁結(jié)構(gòu)，與植物們抵抗病源入侵的防御機制密切相關(guān)。二者作為病程相關(guān)蛋白，受病原菌侵染、機械損傷、環(huán)境脅迫等條件的誘導(dǎo)。El Ghaouth等[45]研究顯示，UV-C照射處理能夠誘導(dǎo)桃果實中這兩種酶活性的提高。在本研究中，低劑量UV-C處理能誘導(dǎo)果實中幾丁質(zhì)酶和GLU活性的上升，但對兩種酶的影響模式不同：經(jīng)3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2劑量UV-C處理后蘋果果實的幾丁質(zhì)酶活性始終高于對照，且與對照差異顯著（P＜0.01），而GLU活性在貯藏前期與對照差異不顯著，但是在貯藏后期顯著高于對照，該結(jié)果與陳麗等[46]的一致。

酚類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物，與果蔬的成熟衰老和抗病性密切相關(guān)。苯丙烷類代謝途徑是酚類物質(zhì)的主要合成途徑，PAL是此途徑的關(guān)鍵酶。POD、PPO不僅參與苯丙烷類代謝途徑，與酚類物質(zhì)合成有關(guān)，還參與活性氧代謝。而果實最初的防御反應(yīng)就是活性氧的產(chǎn)生，活性氧的積累不僅可以作為毒素殺死真菌，而且可以誘發(fā)果實的防御體系[47]。大量研究表明，UV-C照射可誘導(dǎo)果蔬中PAL、POD、PPO等防御酶活性的提高。榮瑞芬等[48]報道，UV-C照射誘導(dǎo)綠熟番茄果皮中防御酶活性升高，POD和PPO活性在處理后第2天分別提高了1.3 倍和1.13 倍，PAL活性在第4天提高了1.69 倍。草莓經(jīng)UV-C照射處理24 h后，PAL和POD的活性顯著上升[49]。本研究表明，低劑量的UV-C能夠誘導(dǎo)蘋果果實中PAL、POD、PPO三種酶活性的提高，7.0 kJ/m2劑量UV-C處理的效果最為顯著；10.5 kJ/m2UV-C照射可誘導(dǎo)這3 種酶活性急劇上升，高峰提前，但之后活性急劇下降，甚至低于對照。

隨著PAL、POD、PPO三種酶活性的提高，總酚和類黃酮含量也持續(xù)增加，7.0 kJ/m2劑量UV-C處理的總酚和類黃酮含量分別在接種后第5天和第4天達到最大值，較對照均提前1 d。在整個觀察期3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2劑量UV-C處理組的總酚和類黃酮含量都始終高于對照，發(fā)病率與病斑直徑也較對照低；10.5 kJ/m2劑量UV-C處理的總酚和類黃酮含量在接種后迅速上升，到第2天達到高峰，而該處理在感病前期的發(fā)病率與病斑直徑都低于對照，但是后期隨著病斑的不斷擴大，果實迅速衰敗，抗性降低，總酚和類黃酮含量也呈現(xiàn)下降的趨勢，甚至低于對照。以上結(jié)果表明總酚和類黃酮含量與果實的抗病性呈正相關(guān)，且低劑量（3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2）UV-C照射能夠誘導(dǎo)果實的抗病性。

本實驗結(jié)果顯示，3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2劑量UV-C照射能夠顯著降低蘋果果實灰霉發(fā)病率，抑制病斑擴展，誘導(dǎo)多種防御酶活性及抗性物質(zhì)含量的提高，且7.0 kJ/m2UV-C照射的效果顯著好于3.5 kJ/m2UV-C照射（P＜0.01）；而10.5 kJ/m2劑量UV-C照射僅在感病初期對灰霉病具有抑制作用，誘導(dǎo)防御酶活性及酚類物質(zhì)含量的提高，后期卻加重灰霉病的發(fā)生，防御酶活性和酚類物質(zhì)含量也隨之降低。這表明低劑量短波UV-C照射能夠誘導(dǎo)果實產(chǎn)生抗病機制，提高蘋果采后抗病性，并且隨著照射劑量的增加誘導(dǎo)效果增強；而高劑量的UV-C照射能夠誘導(dǎo)果實迅速作出防御反應(yīng)，抑制灰霉發(fā)生，但是這種防御作用不能消除高劑量UV-C照射對果實造成的傷害，最終加速病害的發(fā)生與發(fā)展。接種灰葡萄孢后，果實發(fā)病迅速，病斑很快擴及全果，這推進了果肉組織的衰老和防御功能的衰退，進而導(dǎo)致防御酶活性與酚類物質(zhì)含量在感病后期下降，并且這種變化滯后于病斑的迅速擴展。

本實驗僅就幾種抵御酶活性及酚類物質(zhì)含量方面對UV-C照射的誘導(dǎo)作用進行了初步探索，未能從分子水平和顯微結(jié)構(gòu)方面展開研究。UV-C照射誘導(dǎo)抗病性可能涉及到更為復(fù)雜的生理生化過程，其機理還需進行深入研究。

4 結(jié) 論

不同劑量UV-C照射處理對蘋果采后灰霉病的抑制效果不同：低劑量（3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2）UV-C照射處理可有效抑制蘋果采后灰霉病的發(fā)生與發(fā)展，能夠較好地降低發(fā)病率，減小病斑直徑，并且隨著照射劑量的增加抑制效果增強；高劑量（10.5 kJ/m2）UV-C照射處理僅在接種灰葡萄孢初期抑制灰霉病的發(fā)生，隨后卻加重病害發(fā)展。

UV-C處理可誘導(dǎo)蘋果果實中幾丁質(zhì)酶、GLU、POD、PPO以及PAL活性的提高，增加總酚和類黃酮含量。不同劑量UV-C照射處理的誘導(dǎo)模式不盡相同。3.5 kJ/m2和7.0 kJ/m2劑量UV-C照射處理對幾丁質(zhì)酶、POD、PPO以及PAL活性的誘導(dǎo)作用在整個觀察期內(nèi)均顯著，對GLU的誘導(dǎo)作用僅在發(fā)病顯著。10.5 kJ/m2劑量UV-C照射能誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶、POD、PPO以及PAL活性迅速上升，但在發(fā)病后期誘導(dǎo)效果不明顯。

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Effects and Mechanism of UV-C Treatments on Control of Botrytis cinerea in Postharvest Apples

ZHANG Xiaoxiao, ZHOU Huiling*, TIAN Rong, ZHOU Xiaowan, FAN Sheng
(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

This study aimed to investigate the effects and mechanism of UV-C treatments on control of botrytis in postharvest apples. Red Fuji apple fruits were treated by UV-C at different doses (3.5, 7.0, and 10.5 kJ/m2) and, two days later at normal temperature (20 ± 1) ℃, inoculated with conidial suspension of Botrytis cinerea, and inoculated samples without UV-C treatment were used as control. The results showed that UV-C treatments at 3.5 and 7.0 kJ/m2signifi cantly decreased the incidence of gray mold rot, and effectively suppressed the expansion of lesions caused by B. cinerea, and the suppression effect of UV-C treatment at 7.0 kJ/m2UV-C on gray mold was better than at 3.5 kJ/m2. However, UV-C treatment at 10.5 kJ/m2had an adverse effect on gray mold of apple fruits only after inoculation for the earlier days while at the later stage after inoculation, and even increased morbidity of fruits and promoted the expansion of lesions. In addition, the activities of chitinase (CHT), β-1,3-glucanase (GLU), peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO) and phenylalanine ammonia-lyase (PAL) of apple fruits were promoted remarkably by UV-C treatments at 3.5 and 7.0 kJ/m2, and phenolics content was also increased signifi cantly. The promoting effects of UVC-treatment at 10.5 kJ/m2on those defense enzymes activities and phenolics content was found only in the fi rst several days after inoculation.

apple; gray mold; UV-C; disease control; mechanisms; defense enzyme activity

S184

A

1002-6630（2015）02-0242-08

10.7506/spkx1002-6630-201502047

2014-06-25

國家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（nycylx-08-05-02）；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)專項（Z109021201）

張曉曉（1989—），女，碩士，研究方向為園藝產(chǎn)品采后生理及貯藏保鮮。E-mail：1049873144@qq.com

*通信作者：周會玲（1969—），女，副教授，博士，研究方向為園藝產(chǎn)品采后處理及貯藏保鮮。E-mail：zhouhuiling@nwsuf.edu.cn