雞TLR4基因抗沙門氏菌的研究進(jìn)展

胡文元 李琦華豆騰飛 榮 華葛長(zhǎng)榮 賈俊靜劉麗仙，2* （云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明65020；2云 南 農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明 65003)

沙門氏菌感染引起的畜禽疾病給當(dāng)代養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，使得沙門氏菌病成為焦點(diǎn)而被持續(xù)爭(zhēng)論和關(guān)注。由于該病呈垂直和水平兩種方式傳播，且隱性感染家禽不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，使得控制和解決沙門氏菌污染成為世界性的難題。

目前控制該病多利用凈化手段和飼喂抗生素的方法，然而由于抗生素的大量使用使得耐藥菌株不斷出現(xiàn)且造成了抗生素殘留問題。由于沙門氏菌感染與機(jī)體狀況有關(guān)，所以，在抵抗沙門氏菌感染過程中機(jī)體自身固有的免疫系統(tǒng)起到了決定性的作用。因此，尋找與免疫相關(guān)的候選基因至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因可作為抗沙門氏菌感染的候選基因。TLR4作為內(nèi)毒素脂多糖(LPS)最重要的模式識(shí)別受體，不僅是連接獲得性免疫和先天性免疫的橋梁，在抗感染過程中調(diào)節(jié)獲得性免疫，發(fā)揮著天然免疫的作用，還在介導(dǎo)革蘭氏陰性菌及其LPS的宿主反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1]。

1 TLR4基因的結(jié)構(gòu)分布

HashimotoC等在研究果蠅胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)了Toll樣受體[2]。自1997年以后，與Toll類似的一組蛋白被研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，稱為Toll樣受體，TLR4是TLRs家族的重要成員之一，首先由Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)。到目前為止至少有13種TLRs被發(fā)現(xiàn)，在雞上已發(fā)現(xiàn)11種。作為機(jī)體的第一道防線，它們?cè)跈C(jī)體各組織中廣泛分布，并能特異性識(shí)別大量病原體及組織代謝產(chǎn)物，為機(jī)體抵抗外源病菌入侵提供可靠保障。

在家禽及其抗沙門氏菌感染與免疫的研究上，對(duì)于TLR4的研究還處于初級(jí)階段。Leveque等[4]通過比較基因組學(xué)方法，首次克隆了雞的TLR4基因。該基因定位于雞17號(hào)染色體上，編碼843個(gè)氨基酸，序列全長(zhǎng)4452bp，共有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。由于第三外顯子較長(zhǎng)，為2260bp，因此雞TLR4基因的SNP主要集中在第三外顯子區(qū)域。雞TLR4的兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)域分別為934bp和984bp。2個(gè)內(nèi)含子區(qū)域也含有較為豐富的SNP，這些SNP與外顯子的SNP為研究SNP與雞抗革蘭氏陰性菌的關(guān)系提供了豐富的遺傳材料。

2 雞TLR4基因的研究進(jìn)展

2.1 沙門氏菌感染對(duì)TLR4基因表達(dá)的影響

目前研究表明，家禽的腸道和脾臟在抵抗沙門氏菌感染的局部免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。Abasht等[5]對(duì)雞感染沙門氏菌后機(jī)體內(nèi)各組織器官TLRs的mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同品系的雞群中，F(xiàn)ayouni雞與來航雞相比，TLR4在盲腸和脾臟中的表達(dá)量差異顯著。感染組與對(duì)照組相比，雛雞腸炎沙門氏菌感染后，TLR4基因的表達(dá)水平在盲腸和脾臟中明顯上調(diào)，并通過分析發(fā)現(xiàn)在盲腸中TLR4的表達(dá)量與盲腸的沙門氏菌載菌量呈極顯著相關(guān)[6]。李鵬等[7]研究表明，感染沙門氏菌組TLR4基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，并在感染后的第3和第7天mRNA的表達(dá)量達(dá)到了極顯著水平。Sadeyen等[8]通過對(duì)雞沙門氏菌易感和抗性品系進(jìn)行TLR4基因mRNA表達(dá)水平的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，在沙門氏菌感染7天后，TLR4基因在抗性品系雞的組織器官中的表達(dá)水平極顯著高于易感品系雞，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合成酶基因的表達(dá)量在抗病品系雞中也極顯著高于易感品系，說明了TLR4基因的表達(dá)量與機(jī)體免疫相關(guān)基因存在著不同程度的相關(guān)性，同時(shí)也表明了在發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子幫助下，TLR4基因可能為宿主提供沙門氏菌感染的危險(xiǎn)信號(hào)。所以沙門氏菌感染與TLR4基因的表達(dá)水平存在著緊密的相關(guān)性。

2.2 沙門氏菌感染與TLR4基因多態(tài)性的關(guān)系

目前對(duì)于沙門氏菌感染與雞TLR4基因的多態(tài)性的關(guān)系[9]的研究進(jìn)展比較緩慢。研究表明，雞TLR4基因第三外顯子上有2個(gè)突變位點(diǎn)，可造成編碼TLR4蛋白的氨基酸發(fā)生改變，進(jìn)而引起機(jī)體對(duì)沙門氏菌感染產(chǎn)生不同反應(yīng)[10，11]。宋詠梅等[12]利用基因組直接測(cè)序法對(duì)引進(jìn)品種雞和地方品種雞進(jìn)行TLR4基因的部分序列單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，SNP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，共檢測(cè)到36個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)TLR4基因編碼序列的突變位點(diǎn)與機(jī)體對(duì)于病原菌的抗性具有重要作用。還有研究表明，雞TLR4基因上的突變可能與機(jī)體沙門氏菌載菌量相關(guān)。Beaumont等[13]研究報(bào)道雞TLR4與沙門氏菌易感性相關(guān)，試驗(yàn)以產(chǎn)蛋母雞為研究素材，在TRL4序列中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs，這些突變位點(diǎn)與某些組織器官的沙門氏菌載菌量有一定的相關(guān)性，尤其是在盲腸和卵巢中顯著相關(guān)。Malek等[14]對(duì)雞的遺傳資源群體進(jìn)行了TLR4基因內(nèi)含子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TLR4基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)1個(gè)G156C的SNP突變位點(diǎn)。進(jìn)一步做關(guān)聯(lián)分析表明，該SNP與脾臟載菌量呈中度相關(guān)，并且還發(fā)現(xiàn)TLR4基因與雞抗沙門氏菌感染存在一定相關(guān)。Leveque等[4]以沙門氏菌抗感和易感品系作比較，通過序列遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，在TLR4基因第三外顯子編碼區(qū)域共發(fā)現(xiàn)TLR4基因的14個(gè)突變位點(diǎn)。經(jīng)預(yù)測(cè)分析表明，在保守區(qū)域有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變進(jìn)而導(dǎo)致氨基酸的改變；在非保守區(qū)域的2個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致了氨基酸發(fā)生改變，而且這2個(gè)突變位點(diǎn)引起氨基酸改變僅存在于易感品系的商品代雞的基因組信息中。因此，Leveque等表明，TLR4基因有可能為宿主抗沙門氏菌感染相關(guān)的候選免疫基因。劉艷等[15]以紅色原雞與14個(gè)地方品種雞為試驗(yàn)對(duì)象，通過PCR-SSCP技術(shù)對(duì)TLR4基因第二外顯子的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果基因分型發(fā)現(xiàn)在第二外顯子區(qū)域有3種基因型AA、AB和BB，分析認(rèn)為BB基因型可能是機(jī)體免疫應(yīng)答的有利基因型，對(duì)于抗沙門氏菌感染具有一定的免疫應(yīng)答作用。陶志云等[16]對(duì)我國(guó)4個(gè)地方雞種的TLR4基因第2內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，在1 894bp處有1個(gè)為G-C替換的SNP位點(diǎn)，這一SNP導(dǎo)致種間基因型差異顯著，并推測(cè)出品種間對(duì)特定病原菌及其所引發(fā)的免疫反應(yīng)類型具有較大差異。因此研究表明，TLR4基因很有可能為宿主抗沙門氏菌感染相關(guān)的候選免疫基因。

3 展望

采用免疫遺傳學(xué)原理篩選與沙門氏菌感染有關(guān)的抗病基因可為選育抗病新品種提供可靠依據(jù)。因此，探索TLR4基因的作用機(jī)制為尋找預(yù)防和治療沙門氏菌感染提供了新的思路和方法，為畜禽的分子標(biāo)記輔助選育、抗病品種選育和疾病防治等方面的研究提供理論依據(jù)。

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