黑皺鰓金龜甲殼素提取工藝研究

張建英，賈 龍，楊貴軍，石曉莉

(1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021;2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

黑皺鰓金龜Trematodes tenebrioides (Pallas)又名無后翅金龜子，隸屬于鞘翅目Coleoptera 鰓金龜科Melolonthidae (章有為，1979)。黑皺鰓金龜是世界范圍內(nèi)的一大地下害蟲，為害多種作物和牧草(烏寧等，2002;劉新民和烏寧，2004)，主要分布于包括我國(guó)在內(nèi)的古北區(qū)國(guó)家或地區(qū)(張林林等，2012)。成蟲體中型，長(zhǎng)15.0-16.0 mm，寬6.0-7.5 mm，黑色無光澤，刻點(diǎn)粗大而密，鞘翅卵圓形，具大而密排列不規(guī)則的圓刻點(diǎn)，后翅退化僅留痕跡，略呈三角形(章有為，1979)。成蟲為害幼苗莖、葉，喜食灰菜、刺兒菜及熒菜等野生植物，也是甘草的地下害蟲。幼蟲除主要為害高粱、玉米、大豆、花生(曲明靜等，2011)、土豆(郭成瑾等，2012)、小麥、棉花等作物，嚙食幼苗地下莖和根部，使幼苗滯長(zhǎng)、枯黃、全株枯死;幼蟲也是內(nèi)蒙古典型草原大型土壤動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)種，起著分解動(dòng)植物殘?bào)w和牧畜糞便，分解轉(zhuǎn)化有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)的重要作用。

甲殼素又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)等，是自然界中唯一帶正電荷的天然高分子聚合物，化學(xué)名稱為(1，4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖(王敦等，2004;劉高強(qiáng)等，2007)。主要存在于甲殼動(dòng)物外殼、軟體動(dòng)物內(nèi)骨骼、昆蟲表皮、菌類及藻類等微生物的細(xì)胞壁中(王金華和干信，2003)。每年地球上的生物合成量約為100 億噸，是產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的第二大可再生資源，也是除蛋白之外數(shù)量最大的含氮天然有機(jī)高分子(李維莉和林南英，1999;王敦等，2004;陽(yáng)范文和陳曉明，2012)。甲殼素具有非常優(yōu)秀的再生能力，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和植物纖維素非常相似，具備特殊的理化性質(zhì)，天然無毒、組織相容性良好、可生物降解，其開發(fā)應(yīng)用已涉及工業(yè)、農(nóng)業(yè)、國(guó)防、化工、環(huán)保、食品、醫(yī)藥、保健、美容、紡織等諸多領(lǐng)域(施林妹等，2013;王月等，2013)。目前甲殼素的生產(chǎn)方法主要有酸堿法(張雪和王雪濤，2007;唐義寶和謝晶，2012)、酶法(段元斐等，2007)、電解法(賀淹才等，2000)、發(fā)酵法(周湘池等，2008)、EDTA 法(何蘭珍等，2008)等。通過前人從蠅、蠶等一些蟲種中提取甲殼素的研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲中甲殼素含量比較高，鈣和重金屬含量低，雜質(zhì)少，純度高，質(zhì)量好，提取過程中對(duì)水、酸、堿消耗少，生產(chǎn)成本低。因此，昆蟲甲殼素要優(yōu)于蝦、蟹甲殼素，開發(fā)新的甲殼素資源具有重要的意義，而資源量大、種類多的昆蟲正是潛在的甲殼素來源。據(jù)估算昆蟲的總生物量超過了地球上所有動(dòng)物總生物量，適應(yīng)能力和分布范圍都超過了其它動(dòng)物群，但被人類利用的昆蟲資源卻很少，只占昆蟲種類的萬分之一左右，因而昆蟲甲殼素資源是有待開發(fā)的優(yōu)勢(shì)資源(吉惠杰和馬艷麗，2012)。

目前國(guó)內(nèi)已有蠶蛹、蜣螂、蟋蟀等昆蟲中甲殼素的提取報(bào)道，但有關(guān)甲蟲中甲殼素資源的開發(fā)信息甚少。因此，本試驗(yàn)擬以黑皺鰓金龜為材料，采用酸堿法研究甲殼素的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

黑皺鰓金龜成蟲干粉，成蟲采自內(nèi)蒙古烏審旗。樣品預(yù)處理:洗凈→烘干(60℃)→研磨→過篩→黑皺鰓金龜干粉。

1.1.2 主要儀器及用具

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;馬弗爐sx4-10，深圳市中達(dá)電爐廠;紅外光譜儀，德國(guó)布魯克;低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;PH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;研缽;稱量瓶;三角瓶等。

1.1.3 主要試劑

檸檬酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、標(biāo)準(zhǔn)甲殼素樣品(美國(guó)進(jìn)口C9752-250MG)、高錳酸鉀(分析純)、草酸(分析純)、蒸餾水(水洗使用)。

1.2 方法

試驗(yàn)利用酸浸堿煮法，首先，通過單因素試驗(yàn)對(duì)氫氧化鈉濃度、堿浸固液比、堿浸時(shí)間、堿浸溫度、檸檬酸濃度、酸浸固液比、酸浸時(shí)間等七個(gè)因素進(jìn)行探究，以殘余蛋白質(zhì)和灰分含量為考察指標(biāo)，確定從黑皺鰓金龜中提取甲殼素的初步制備工藝條件;再以單因素試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以優(yōu)化工藝條件，采用紫外吸收法測(cè)定殘留蛋白質(zhì)含量(陳毓荃，2002)，以殘留蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)來衡量氫氧化鈉脫除蛋白質(zhì)的效果;采用干法灰化法測(cè)定灰分含量 (參見GB 5009.4-2010)，以殘留灰分為指標(biāo)來衡量檸檬酸脫除無機(jī)鹽的效果;最后按照正交試驗(yàn)所得的最佳工藝條件進(jìn)行甲殼素的提取并利用紅外光譜比對(duì)法進(jìn)行定性分析并計(jì)算其得率。蛋白質(zhì)(μg/mL)=(1.45A280-0.74A260)×稀釋倍數(shù);總灰分(%)=(恒重后坩堝和灰分重量-恒重后坩堝重量)/樣品重量×100。

1.2.1 單因素試驗(yàn)脫除蛋白質(zhì)條件的探究

影響脫除蛋白質(zhì)效果的有氫氧化鈉濃度、堿浸溫度、堿浸時(shí)間、固液比等四個(gè)因素。在單因素試驗(yàn)探究中，將其中三個(gè)因素固定為固定值，第四個(gè)因素設(shè)計(jì)成五個(gè)水平，以殘留蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)來確定上述五個(gè)水平那哪個(gè)為最適值。

1.2.2 單因素試驗(yàn)脫除無機(jī)鹽條件的探究

影響脫除無機(jī)鹽效果的有檸檬酸濃度、酸浸時(shí)間、固液比等三個(gè)因素。在單因素試驗(yàn)探究中，在室溫條件下，將其中兩個(gè)因素固定為固定值，第三個(gè)因素設(shè)計(jì)成五個(gè)水平，以殘留灰分含量為指標(biāo)來確定上述五個(gè)水平哪個(gè)為最適值。

1.2.3 氫氧化鈉脫除蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)得到的最適氫氧化鈉濃度、堿浸時(shí)間、堿浸溫度、固液比的基礎(chǔ)上，選擇氫氧化鈉濃度、堿浸時(shí)間、堿浸溫度、固液比四個(gè)因素為考察對(duì)象，在單因素試驗(yàn)得到的四個(gè)因素最適值兩端再各取一個(gè)水平，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，重復(fù)2 次。

表1 脫除蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of deproteinization orthogonal experiment

1.2.4 檸檬酸脫除無機(jī)鹽的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)得到的最適檸檬酸濃度、酸浸時(shí)間、固液比的基礎(chǔ)上，在室溫條件下，選擇檸檬酸濃度、酸浸時(shí)間、固液比三個(gè)因素為考察對(duì)象，在單因素試驗(yàn)得到的三個(gè)因素最適值兩端再各取一個(gè)水平，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，重復(fù)2 次。

1.2.5 甲殼素的制備的工藝流程

新鮮甲蟲→預(yù)處理→脫除蛋白質(zhì)→水洗至中性→脫除無機(jī)鹽→水洗至中性→干燥→脫色→甲殼素樣品(彭元懷等，2012)。

1.2.6 甲殼素的定性定量分析

甲殼素定性檢測(cè)采用紅外光譜對(duì)比法:分別將標(biāo)準(zhǔn)甲殼素和所制備的甲殼素烘干，2 mg 待測(cè)樣品與100 mg KBr 混合，通過壓片法制成薄片，用紅外光譜儀掃描范圍400-4000/cm (包淑云等，2012)，通過對(duì)比兩者的紅外光譜圖，確定本研究制備的樣品是否為甲殼素。

甲殼素得率計(jì)算方法(王敦等，2004;郭寶華，2005):甲殼素含量(%)=(所提甲殼素重量干重W1)/ (所用該種昆蟲干重W2)×100

表2 脫除無機(jī)鹽的正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of demineralization orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)脫除蛋白質(zhì)條件的探究

2.1.1 氫氧化鈉濃度的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，依次以固液比1∶12 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、6%、8%、10%、12%氫氧化鈉溶液，置于90℃水浴鍋中恒溫5 h，水洗至中性，得脫除蛋白質(zhì)的黑皺鰓金龜粉，測(cè)定其殘余蛋白質(zhì)含量，重復(fù)3 次，結(jié)果見圖1。氫氧化鈉濃度越高，脫除蛋白質(zhì)的效果越好，氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%時(shí)，殘余蛋白質(zhì)含量0.760 μg/mL，而氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 時(shí)，殘余蛋白質(zhì)含量0.701 μg/mL，即當(dāng)氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8%后，對(duì)脫除蛋白質(zhì)的影響效果不大，且隨著氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加易使甲殼素脫乙?；蓺ぞ厶?。因此，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的氫氧化鈉溶液浸泡即可。

圖1 堿濃度對(duì)脫除蛋白質(zhì)的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on deproteinization

2.1.2 堿浸溫度的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，以固液比1∶12、質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%加入氫氧化鈉溶液，分別置于80℃、85℃、90℃、95℃、100℃水浴鍋中恒溫5 h 后水洗至中性，得脫除蛋白質(zhì)的黑皺鰓金龜粉，測(cè)定其殘余蛋白質(zhì)含量，重復(fù)3 次。結(jié)果見圖2。隨著堿浸溫度的升高，殘余蛋白質(zhì)含量急劇下降，脫除蛋白質(zhì)效果明顯;當(dāng)達(dá)到85℃以后，殘余蛋白質(zhì)含量下降的趨勢(shì)減緩。溫度對(duì)氫氧化鈉水解蛋白質(zhì)有很大的影響，在其它條件固定的情況下，反應(yīng)溫度越高，蛋白質(zhì)堿水解的速度越快;但溫度達(dá)到一定值時(shí)，蛋白質(zhì)堿水解速度開始變慢，蛋白質(zhì)的堿水解反應(yīng)趨于平衡，繼續(xù)升溫對(duì)脫除蛋白效果影響不大。同時(shí)考慮到高溫反應(yīng)會(huì)增加生產(chǎn)成本，因此，選擇堿浸溫度85℃即可。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)脫除蛋白質(zhì)的影響情況Fig.2 Effect of temperature on deproteinization

2.1.3 堿浸時(shí)間的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，以固液比1∶12、質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、水浴溫度90℃，分別恒溫1 h、3 h、5 h、7 h、9 h 后水洗至中性，得脫除蛋白質(zhì)的黑皺鰓金龜粉，測(cè)定其殘余蛋白質(zhì)含量，重復(fù)3 次。結(jié)果見圖3。在反應(yīng)的初始階段，隨著堿浸時(shí)間的延長(zhǎng)，殘余蛋白質(zhì)含量急劇下降，脫除蛋白效果明顯;在5 h 后其蛋白質(zhì)含量總體雖在下降，但下降的趨勢(shì)減緩。一般來說，脫除蛋白質(zhì)時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)水解的越徹底，但水解速度逐漸減慢;當(dāng)延長(zhǎng)到某一時(shí)刻以后，蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)進(jìn)行得非常緩慢，其對(duì)脫除蛋白效果的影響便不再明顯。同時(shí)考慮到長(zhǎng)時(shí)間高溫反應(yīng)會(huì)帶來生產(chǎn)成本上的增加，因此，選擇堿浸時(shí)間5 h 即可。

圖3 堿浸時(shí)間對(duì)脫除蛋白質(zhì)的影響情況Fig.3 Effect of reaction time on deproteinization

2.1.4 堿浸固液比的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，分別以固液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%氫氧化鈉溶液，置于90℃水浴鍋中恒溫5 h，水洗至中性，得脫除蛋白質(zhì)的黑皺鰓金龜粉，測(cè)定其殘余蛋白質(zhì)含量，重復(fù)3 次。結(jié)果見圖4。固液比對(duì)反應(yīng)的影響不是很明顯，但固液比越大，脫除蛋白質(zhì)的效果越好，固液比1∶10 時(shí)，殘余蛋白質(zhì)含量為0.371 μg/mL，而當(dāng)固液比1∶12 時(shí)，殘余蛋白質(zhì)含量為0.329 μg/mL，即當(dāng)固液比大于1∶10 時(shí)，對(duì)除蛋白質(zhì)的影響不是很大，因此，選擇固液比1∶10 浸泡即可。

圖4 固液比對(duì)脫除蛋白質(zhì)的影響情況Fig.4 Effect of ratio of liquid to material removal of protein

2.2 單因素試驗(yàn)脫除無機(jī)鹽條件的探索

2.2.1 檸檬酸濃度的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000g，分別置于錐形瓶中，室溫條件下，以固液比1∶11 分別加入濃度0.6 g ∕L、1.0 g/L、1.4 g/L、1.8 g/L、2.2 g/L檸檬酸溶液，反應(yīng)時(shí)間30 h，水洗至中性，得脫除無機(jī)鹽黑皺鰓金龜粉，測(cè)定其灰分含量，重復(fù)3 次。結(jié)果見圖5。隨著檸檬酸濃度的增加，灰分含量逐漸下降，脫除無機(jī)鹽效果明顯;檸檬酸濃度達(dá)到1.4 g/L 后其灰分含量總體也在下降，但下降趨勢(shì)不明顯，當(dāng)濃度由1.4 g/L 變?yōu)?.8 g/L時(shí)，灰分含量由1.70% 變?yōu)?.57%，灰分含量減少量不大，且隨著檸檬酸濃度的增加甲殼素易于水解。同時(shí)考慮在實(shí)際操作中，檸檬酸濃度過高會(huì)使反應(yīng)速率過快而不易控制，因此，選擇檸檬酸濃度1.4 g/L 較為合適。

圖5 檸檬酸濃度對(duì)脫除無機(jī)鹽的影響情況Fig.5 Effect of citric acid concentration on demineralization

2.2.2 酸浸時(shí)間的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000g，分別置于錐形瓶中，室溫條件下，以固液比1∶11 加入濃度1.4 g/L 檸檬酸溶液，恒溫20 h、25 h、30 h、35 h、40 h，水洗至中性，得脫除無機(jī)鹽黑皺鰓金龜粉，測(cè)定其灰分含量，重復(fù)3 次。結(jié)果見圖6。在反應(yīng)的初始階段，隨著酸浸時(shí)間的延長(zhǎng)，灰分含量急劇下降，脫除無機(jī)鹽效果明顯;達(dá)到25 h以后其灰分含量總體也在下降，但下降趨勢(shì)減緩。由于殼中碳酸鈣是與甲殼素以及蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，在檸檬酸與碳酸鈣的反應(yīng)中，部分碳酸鈣被甲殼素緊密的膠狀分子團(tuán)結(jié)構(gòu)所包圍，檸檬酸很難完全滲透到里面，導(dǎo)致其不能徹底與其反應(yīng)完全。當(dāng)達(dá)到25 h 以后，檸檬酸和碳酸鈣的反應(yīng)基本達(dá)到平衡，再延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)脫除無機(jī)鹽效果的影響不大。因此，選擇酸浸時(shí)間為25 h 即可。

圖6 酸浸時(shí)間對(duì)脫除無機(jī)鹽的影響情況Fig.6 Effect of reaction time on demineralization

2.2.3 酸浸固液比的確定

準(zhǔn)確稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，室溫條件下，分別以固液比1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15 加入濃度1.4 g/L 的檸檬酸溶液，恒溫30 h，水洗至中性，得脫除無機(jī)鹽黑皺鰓金龜粉。測(cè)定其灰分含量，重復(fù)3 次。結(jié)果見圖7。固液比由1∶9 變至1∶11 時(shí)，灰分含量下降趨勢(shì)較為明顯，由2.39% 變?yōu)?.55%，而當(dāng)固液比由1∶11 變至1∶13 時(shí)灰分含量有所減少但很緩慢，由1.55% 變?yōu)?.52%，因此，選擇固液比1∶11 浸泡洗脫除無機(jī)鹽即可。

圖7 酸浸固液比對(duì)脫除無機(jī)鹽的影響情況Fig.7 Effect of liquid-solid ratio on demineralization

2.3 氫氧化鈉脫除蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)

稱取9 份黑皺鰓金龜干粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，按表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9種組合進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)2 次取平均值。結(jié)果見表3。由正交試驗(yàn)結(jié)果可得最佳試驗(yàn)條件為A2、B1、C2、D2，即氫氧化鈉濃度8%，固液比1∶10，在85℃下反應(yīng)4 h即可。且又由結(jié)果可得A ＞C ＞B ＞D，即四個(gè)因素影響脫除蛋白質(zhì)的主次順序?yàn)?反應(yīng)溫度＞固液比＞堿浸時(shí)間＞氫氧化鈉溶液濃度。

表3 脫除蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of deproteinization

2.4 檸檬酸脫除無機(jī)鹽的正交試驗(yàn)

稱取9 份黑皺鰓金龜干粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，按表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9種組合進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)2 次取平均值。結(jié)果見表4。由正交試驗(yàn)結(jié)果可得最佳條件為A2、B3、C3，即檸檬酸濃度1.6 g/L，固液比1∶12，在室溫條件下反應(yīng)25 h 即可，且又由結(jié)果可得B ＞C ＞A，即在室溫條件下，三個(gè)因素影響檸檬酸脫除無機(jī)鹽的主次順序?yàn)?檸檬酸濃度＞固液比＞反應(yīng)時(shí)間。

2.5 甲殼素的制備及其定性定量分析

2.5.1 甲殼素的制備

按照正交試驗(yàn)得到的最佳試驗(yàn)條件，將準(zhǔn)確稱取的黑皺鰓金龜干粉置于錐形瓶中，以固液比1∶10 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%氫氧化鈉溶液，置于溫度為85℃反應(yīng)4 h，水洗至中性，得脫除蛋白質(zhì)黑皺鰓金龜粉，烘干后再以固液比 1∶12 加入濃度1.6 g/L，的檸檬酸溶液，置于室溫條件下恒溫25 h，水洗至中性，烘干后可得脫除蛋白質(zhì)與無機(jī)鹽的粗產(chǎn)品，再進(jìn)行脫色處理(張雪和王雪濤，2007)，用3%的高錳酸鉀溶液，以固液比1∶10，在室溫下處理0.5 h，再用2%草酸溶液以固液比1∶20，在70℃進(jìn)行還原脫色處理，即可得到白色蓬松的甲殼素產(chǎn)品。

2.5.2 甲殼素的定性分析

甲殼素的紅外吸收光譜分析，對(duì)在最佳條件下制備的甲殼素產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量分析與結(jié)構(gòu)表征。甲殼素產(chǎn)品紅外光譜如圖8 所示，紅外光譜圖中3400 cm-1是O-H 伸縮振動(dòng)吸收峰;3270 cm-1是N-H 伸縮振動(dòng)吸收峰;2960-2879 cm-13 個(gè)吸收峰是C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰;分別在1657、1557、1315 cm-1的吸收峰，分別是酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ譜帶，這3 個(gè)吸收峰是甲殼素的特征吸收峰;1030-1157 cm-1之間的4 個(gè)吸收峰，是C-O 伸縮振動(dòng)吸收峰;897 cm-1是環(huán)伸縮振動(dòng)吸收峰。通過比對(duì)本工藝所得產(chǎn)品和購(gòu)買的甲殼素標(biāo)準(zhǔn)樣品的紅外譜圖可知，本工藝提取的甲殼素與甲殼素標(biāo)樣化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。

表4 脫除無機(jī)鹽的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of demineralization

圖8 兩種樣品的紅外光譜圖Fig.8 IR spectra of two samples

2.5.3 甲殼素的定量分析

在本試驗(yàn)所得最佳工藝流程下制備甲殼素并計(jì)算其得率，結(jié)果分析可得從黑皺鰓金龜中提取甲殼素的得率為24.82% (表5)。

表5 黑皺鰓金龜粉提取甲殼素試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 5 The experimental data of chitin extracted from Trematodes tenebrioides Pallas

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)黑皺鰓金龜甲殼素的提取工藝先進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，然后根據(jù)單因素的最佳條件再進(jìn)行正交試驗(yàn)以優(yōu)化工藝流程。應(yīng)用紫外吸收法分析提取物中的殘余蛋白質(zhì)含量，利用干法灰化法分析提取物中殘余灰分含量。通過對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，又結(jié)合甲殼素在酸性較強(qiáng)的溶液中易分解，溫度高又易降解，而在堿性較強(qiáng)的溶液中易脫乙酰化為殼聚糖的特性，初步確定了黑皺鰓金龜甲殼素提取的最佳工藝條件:氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、浸泡溫度85℃、固液比1∶10、浸泡時(shí)間4 h，檸檬酸濃度1.6 g/L、浸泡固液比1∶12、浸泡時(shí)間25 h，在以上工藝條件下制備的甲殼素產(chǎn)品經(jīng)脫色后為乳白色蓬松固體，得率24.82%.

本試驗(yàn)首次利用黑皺鰓金龜成蟲為試驗(yàn)材料制備甲殼素，結(jié)果顯示，該蟲干粉甲殼素產(chǎn)率達(dá)24.82%，產(chǎn)品顏色呈乳白色絮狀固體;對(duì)其產(chǎn)品進(jìn)行紅外光譜分析，證實(shí)了本試驗(yàn)所制備的物質(zhì)確為甲殼素。昆蟲作為甲殼素制備的材料來源，其自身優(yōu)勢(shì)十分明顯。目前由昆蟲獲得的甲殼素產(chǎn)量、質(zhì)量和提取流程上，具有比蝦蟹殼單位產(chǎn)量高、提取流程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品質(zhì)量高、蛋白含量相對(duì)較少等明顯優(yōu)勢(shì)，具有廣泛利用前景，能夠用于解決多種人類“文明病”。昆蟲類甲殼素制備方面的研究相對(duì)滯后，研究也局限在個(gè)別昆蟲種類。黑皺鰓金龜作為一種農(nóng)業(yè)害蟲，其存在危害著農(nóng)作物的生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)影響著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，將其作為提取甲殼素的原料能夠變害為寶。昆蟲豐富的物種資源以及其巨大的天然合成能力沒有得到相應(yīng)的利用，相信隨著對(duì)大量不同種類昆蟲甲殼素的深入研究，必定能夠利用好這一豐富的天然資源。

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