色季拉山兩種鉤蝠蛾蛹的體型變異及判別分析

喻 浩，郭技星，張劍霜，劉 昕，，張古忍，*

(1.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275;2.中山大學(xué)食品與健康工程研究院，廣州 510275;3.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550018)

鉤蝠蛾屬昆蟲Thitarodes (鱗翅目Lepidoptera，蝙蝠蛾科Hepialidae)是冬蟲夏草寄主之一(鄒志文等，2010)，其幼蟲被冬蟲夏草菌寄生后形成冬蟲夏草，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義 (張古忍等，2011)。鉤蝠蛾屬昆蟲為完全變態(tài)昆蟲，都經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4 個(gè)不同時(shí)期，在自然環(huán)境條件下完成1 個(gè)生活世代需4-6年左右(朱印酒等，2009;李峻鋒等，2011)。

鉤蝠蛾表現(xiàn)出明顯的狹域分布的特點(diǎn)，在野外調(diào)查中通常能在不同的山脈發(fā)現(xiàn)不同種類的鉤蝠蛾，甚至在非常小的尺度內(nèi)，如同一山脈的不同的坡向、海拔、植被中都分布著不同種類的鉤蝠蛾。這種分布模式造成了一種客觀結(jié)果:在某個(gè)冬蟲夏草產(chǎn)地，若干種鉤蝠蛾其分布地點(diǎn)非常接近，生態(tài)位大量重疊，近乎于同域分布，加之其相似的外部形態(tài)、生活史、行為特征，諸多因素都使得這些鉤蝠蛾的分辨和鑒定異常困難。

色季拉山位于西藏自治區(qū)林芝縣以東，是冬蟲夏草的產(chǎn)地之一。目前已報(bào)道分布于色季拉山的鉤蝠蛾屬昆蟲有2種，分別為蒲氏鉤蝠蛾(張古忍等，2007)與色季拉鉤蝠蛾 (Zou et al.，2011)，兩者分布地點(diǎn)接近但成蟲形態(tài)上有較大差異，因此較易區(qū)分。盡管如此，短暫的成蟲期(約3-8 d)仍使得成蟲標(biāo)本的獲得受限，從而造成物種及性別的鑒定困難，限制了種資質(zhì)源調(diào)查活動(dòng)及其他相關(guān)研究工作的開展，同時(shí)對(duì)室內(nèi)飼養(yǎng)的管理產(chǎn)生不便。事實(shí)上，兩種鉤蝠蛾均需經(jīng)歷長(zhǎng)于40 d 的蛹期，遠(yuǎn)長(zhǎng)于其成蟲存活時(shí)間(李峻峰，2011)，因此應(yīng)考慮通過蛹來鑒定兩種鉤蝠蛾的種類和性別的可行性。

數(shù)量形態(tài)學(xué)研究不僅可以獲得物種的形態(tài)特征信息，還可以反映出種間及種內(nèi)的差異程度，也是對(duì)進(jìn)化關(guān)系、遺傳多樣性等進(jìn)行研究的重要方法之一，在種類或種群辨別分析中具有一定的準(zhǔn)確性和實(shí)用性(Fischer et al.，2011;Lewandowski et al.，2014)。而在昆蟲分類的相關(guān)研究中，利用數(shù)量性狀變異來區(qū)分某些形態(tài)差別不顯著的物種也是一種分類手段(喻泓等，2004)。

本文通過測(cè)量和比較色季拉山不同生境的鉤蝠蛾蛹的數(shù)量形態(tài)，獲得其體型數(shù)據(jù)，不僅可了解其變異和遺傳分化，并可在此基礎(chǔ)上快速的識(shí)別鉤蝠蛾蛹的種類及性別，從而可及時(shí)掌握色季拉山鉤蝠蛾種質(zhì)資源的現(xiàn)狀、提前預(yù)測(cè)下代種群動(dòng)態(tài)，為冬蟲夏草資源的可持續(xù)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 鉤蝠蛾昆蟲蛹的采集調(diào)查及飼養(yǎng)

于2010-2012年每年5-6月鉤蝠蛾蛹期階段，對(duì)西藏色季拉山冬蟲夏草發(fā)生地的草甸地區(qū)進(jìn)行調(diào)查，從土壤中采挖取得鉤蝠蛾蛹帶回室內(nèi)，將每個(gè)蛹分別置于含腐殖土的小養(yǎng)蟲杯 (內(nèi)徑4 cm，高4 cm)，并按采集時(shí)間、地點(diǎn)加以歸類。

本研究涉及的蟲蛹主要來自3 個(gè)生境的群體(表1)，其中A 生境屬于典型的色季拉鉤蝠蛾發(fā)生地，B、C 屬于典型的蒲氏鉤蝠蛾發(fā)生地，B、C兩地分別位于色季拉山區(qū)域的東、西邊緣，其間有著較遠(yuǎn)的地區(qū)距離及山脊阻隔，海拔落差200-300 m。

1.2 鉤蝠蛾昆蟲蛹的體型數(shù)據(jù)測(cè)量

形態(tài)測(cè)量指標(biāo)的選擇依據(jù)《中國(guó)動(dòng)物志-昆蟲綱-第三十八卷-鱗翅目-蝙蝠蛾科-蛺蛾科》(朱弘復(fù)等，2004)，按其標(biāo)準(zhǔn)將蛹分節(jié)(圖1A)。對(duì)所有蛹個(gè)體測(cè)量5 個(gè)線性指標(biāo)(圖1):蛹長(zhǎng)度(從蛹頭部頂端到尾部末端的縱向距離，Length-L)、蛹寬度(蛹背面兩側(cè)緣的最長(zhǎng)橫向距離Width-W)、蛹厚度 (蛹背面到腹面的最長(zhǎng)垂直距離Depth-D)、蛹前部長(zhǎng)(I-III 節(jié)在腹面的最長(zhǎng)縱向距離，F(xiàn)orepart length-FL)、蛹后部長(zhǎng)(1-10節(jié)在腹面最長(zhǎng)縱向距離Posterior length-PL)。所有蛹在測(cè)量前，清除其表面附著生物及泥土，同時(shí)為避免蛹自身發(fā)育對(duì)體型數(shù)據(jù)的影響，所有蛹自采集首日起每3 日測(cè)量一次，追蹤測(cè)量至上述指標(biāo)穩(wěn)定為止。測(cè)量采用游標(biāo)卡尺 (精確度0.01 mm)，所有個(gè)體的測(cè)量由一人在24 h 內(nèi)完成。

圖1 色季拉山鉤蝠蛾蛹的體型測(cè)量指標(biāo)圖解A，蛹側(cè)面，示蛹的分節(jié)狀況及厚度、前部、后部測(cè)量;B，蛹背面，示蛹寬度及長(zhǎng)度測(cè)量。Fig.1 Measured characters of pupaeA，Lateral view of pupa，showing segmentation，depth，forepart length and posterior length of pupa;B，Dorsal view of pupa，showing width and length of pupa.

1.3 鉤蝠蛾昆蟲蛹的種類及性別鑒定

通過羽化后的成蟲鑒定相應(yīng)的蛹的性別及種類，不能成功羽化的蛹不參與分析?？傆?jì)成功羽化37 頭個(gè)體，其中來自A 地點(diǎn)的13 頭，雄性7 頭，雌性6 頭、經(jīng)鑒定全部屬于色季拉鉤蝠蛾;來自B 地點(diǎn)的13 頭，雄性7 頭，雌性6 頭，全部屬于蒲氏鉤蝠蛾，可稱為蒲氏鉤蝠蛾西部種群(West population of T.pui，T.pui-W);來自C 地點(diǎn)的11 頭，雄性6 頭，雌性5 頭，全部屬于蒲氏鉤蝠蛾，可稱為蒲氏鉤蝠蛾東部種群 (East population of T.pui，T.pui-E)。所有參與分析個(gè)體其種類、群體及個(gè)體代碼見表1。

表1 色季拉山3 個(gè)鉤蝠蛾群體的受試蛹個(gè)體代碼及分布信息Table 1 Samlping information and individual codes of Thitarodes pupae in Mt.Segrila

1.4 數(shù)據(jù)分析

在研究不同物種或不同群體間的差異時(shí)，通常需排除二型性因素的干擾，從而只選擇一個(gè)性別進(jìn)行分析(Prieto et al.，2009;Cooper et al.，2013)。在本研究中，分別對(duì)不同來源的3 個(gè)種群的鉤蝠蛾兩個(gè)性別都進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)及多重比較、因子分析、主成分分析和聚類分析。并使用判別分析區(qū)分不同種群及不同性別的鉤蝠蛾。

因子分析＆ 主成分分析:用主分量分析(Principal Component Analysis)對(duì)色季拉山鉤蝠蛾的形態(tài)指標(biāo)提取主因子，經(jīng)方差極大法旋轉(zhuǎn)后，輸出載荷以示主因子之間的分布狀態(tài)，對(duì)主因子中的形態(tài)指標(biāo)按特征值比例排序分析。從5 個(gè)指標(biāo)中得出少量綜合性指標(biāo)(因子或主成分)并獲得其貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率。

非參數(shù)均數(shù)比較:(1)性狀選取:在使用因子分析及主成分分析把5 個(gè)形態(tài)特征降維為少量的N 個(gè)綜合指標(biāo)后，在每個(gè)綜合指標(biāo)中選取一個(gè)代表性形狀，另外計(jì)算每個(gè)個(gè)體的前部長(zhǎng)度與后部長(zhǎng)度的比值(FL/PL)，共計(jì)N+1 個(gè)形狀;(2)多樣本多重比較:比較不同來源的3 個(gè)群體選取性狀的均數(shù)，檢驗(yàn)其差異顯著性水平。由于每組的受試樣本量有限且不服從方差岐性，使用非參數(shù)的克羅斯考爾和瓦里斯秩方差分析(Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks)，并使用帶有標(biāo)準(zhǔn)差及標(biāo)準(zhǔn)誤的箱線圖考察組內(nèi)變異。此分析對(duì)兩種性別分別單獨(dú)進(jìn)行;(3)兩樣本比較:比較相同來源群體內(nèi)的兩性別在選取性狀上的均數(shù)，檢驗(yàn)其差異顯著性水平。使用曼-惠特尼U 檢驗(yàn)(Mann-Whitney U test)。

聚類分析:對(duì)雌雄的鉤蝠蛾分別聚類。聚類分析計(jì)算兩次，第一次將所有受試個(gè)體都視作一個(gè)操作單元，聚類樹的分支數(shù)目與受試個(gè)體數(shù)目相同;第二次將一個(gè)群體視作一個(gè)操作單元，本研究涉及3 個(gè)群體，即聚類樹的分支數(shù)目為3。聚類方法為最近鄰體法(Single Linkage)，使用距離測(cè)度系數(shù)為歐氏距離(Euclidean distance)。

判別分析:依據(jù)鉤蝠蛾的來源種群和性別將所有受試個(gè)體劃歸為不同的“型”，通過逐步判別分析建立各型的判別函數(shù)，再據(jù)此函數(shù)對(duì)所有樣本的類別進(jìn)行判別，并檢驗(yàn)其判別準(zhǔn)確率。準(zhǔn)確率的計(jì)算公式為P(%)=判別正確的個(gè)體數(shù)目/實(shí)測(cè)個(gè)體數(shù)目×100，綜合判別率P=∑Ai/∑Bi，其中Ai 為第i 個(gè)型判別正確的個(gè)體數(shù);Bi 為第i 個(gè)型的實(shí)際數(shù)目。

所有統(tǒng)計(jì)使用Statistica 10.0 軟件完成(Hill and Lewicki，2007)。

2 結(jié)果與分析

2.1 因子分析＆主成分分析

分別對(duì)兩個(gè)性別鉤蝠蛾蛹各自的5 個(gè)形態(tài)測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行因子分析(基于主成分抽提法)，使用最大方差的因子旋轉(zhuǎn)方式，在兩個(gè)性別中，方差貢獻(xiàn)率最大的前兩個(gè)因子(主成分)累計(jì)方差占總信息量的比例都超過95%，因此選用前2 個(gè)主成分可以說明數(shù)量性狀變異情況。

表2 鉤蝠蛾蛹體型特征主成分分析的因子載荷及貢獻(xiàn)值Table 2 Contributive proportion and loading of principal components on the morphological characteristics of Thitarodes pupae

在雄性蛹中，因子1 的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到89.38%，在該因子上載荷值較大(大于0.7)的特征包括蛹全長(zhǎng)、蛹前部長(zhǎng)、蛹后部長(zhǎng)，全部為與長(zhǎng)度相關(guān)的特征，因此，因子1 可命名為“縱長(zhǎng)因子”;因子2 的方差貢獻(xiàn)率6.22%，在該因子上載荷值較大的特征包括蛹寬度及蛹厚度，全部為橫向特征，因此，因子1 可命名為“橫切因子”。兩個(gè)因子的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為95.60%，即可解釋幾乎所有的雄性蛹變異。

在雌性蛹中，因子1 的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到83.95%，在該因子上載荷值較大(大于0.7)的特征包括蛹前部長(zhǎng)、蛹寬度、蛹厚度，以橫向特征為主，因此，因子1 可命名為“橫切因子”;因子2 的方差貢獻(xiàn)率13.51%，在該因子上載荷值較大的特征包括蛹長(zhǎng)度及蛹后部，全部為縱向特征，因此，因子1 可命名為“縱長(zhǎng)因子”。兩個(gè)因子的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97.46%，即可解釋幾乎所有的雌性蛹變異。

圖2 色季拉山鉤蝠蛾蛹的主成分分析二位排序散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plots analyzed by principal components for Thitarodes pupaein Mt.Segrila

圖2 為基于第一與第二主成分的個(gè)體散布圖。在雌性中，色季拉鉤蝠蛾的個(gè)體較為集中，通過PC1 即可與蒲氏鉤蝠蛾有明顯的區(qū)分;而蒲氏鉤蝠蛾兩個(gè)群體基本重疊在一起，在兩個(gè)主成分上都有較大離散，表明其非常相近，無法通過數(shù)量形態(tài)特征得以區(qū)分。雄性鉤蝠蛾的散布圖與雌性比較相似，通過PC1 可明確的區(qū)分色季拉鉤蝠蛾與蒲氏鉤蝠蛾，但是無法區(qū)分蒲氏鉤蝠蛾的兩個(gè)群體。

2.2 非參數(shù)均數(shù)比較

由于兩個(gè)性別的鉤蝠蛾的變異均可歸結(jié)為“縱長(zhǎng)因子”和“橫切因子”，則分別在兩因子中選取蛹長(zhǎng)度與厚度作為均數(shù)比較和考察變異的代表性狀特征。

在長(zhǎng)度特征上(圖3A)，蒲氏鉤蝠蛾的兩個(gè)群都表現(xiàn)出相對(duì)較大的變異性，色季拉鉤蝠蛾則較為收斂集中。3 個(gè)群體雌性蛹的長(zhǎng)度差異顯著(H2，17=11.000，P=0.004)，但這種差異主要來自種間，蒲氏鉤蝠蛾的東部群(P=0.016)及西部群(P=0.011)均顯著長(zhǎng)于色季拉鉤蝠蛾，但種內(nèi)兩群之間長(zhǎng)度接近(P=1.000);雄性的蟲蛹比較結(jié)果表現(xiàn)出與雌性相似的趨勢(shì)(H2，20=13.000，P=0.002)，蒲氏鉤蝠蛾內(nèi)部?jī)扇洪L(zhǎng)度差異不顯著(P=1.000)，但東部群(P=0.007)與西部群(P=0.005)和色季拉鉤蝠蛾比較表現(xiàn)出顯著差異;每個(gè)群體內(nèi)部，雌性蛹長(zhǎng)度均顯著長(zhǎng)于雄性(PT.sejia=0.003，PT.pui-E=0.008，PT.pui-W=0.003)。

在厚度特征上(圖3B)，各群的兩性的收斂性都較好，僅蒲氏鉤蝠蛾的雄性變異稍大。3 個(gè)群體雌性蛹的厚度差異顯著(H2，17=11.143，P=0.004)，但這種差異主要來自種間，蒲氏鉤蝠蛾的東部群(P=0.009)及西部群(P=0.018)均顯著厚于色季拉鉤蝠蛾，但種內(nèi)兩群之間厚度接近(P=1.000);雄性的蟲蛹比較結(jié)果表現(xiàn)出與雌性相似的趨勢(shì)(H2，20=13.199，P=0.004)，蒲氏鉤蝠蛾內(nèi)部?jī)扇汉穸炔町惒伙@著(P=1.000)，但東部群(P=0.015)與西部群(P=0.002)和色季拉鉤蝠蛾比較表現(xiàn)出顯著差異;每個(gè)群體內(nèi)部，雌性蛹厚度均顯著大于雄性 (PT.sejia=0.003，PT.pui-E=0.008，PT.pui-W=0.003)。

圖3 3 個(gè)鉤蝠蛾群體蛹數(shù)量性狀特征箱線圖Fig.3 Box and whisker plots showing interspecific differentiation among the three groups of Thitarodes pupae

在蛹的前后部比值這一比例特征上(圖3C)，3 個(gè)群體的雌性比值約在0.80-0.85 之間，彼此間沒有顯著差異(H2，17=0.230，P=0.891);3 個(gè)群體的雄性比值約在1.0-1.1 之間，彼此間沒有顯著差異(H2，20=4.682，P=0.096);每個(gè)群體內(nèi)部，雌性蛹前后部比值均顯著小于雄性(PT.sejia=0.003，PT.pui-E=0.008，PT.pui-W=0.003)。從上述結(jié)果可知，雄性蛹的前、后部長(zhǎng)度較為接近，但是雌性蛹的后部長(zhǎng)度要稍長(zhǎng)于前部。

2.3 聚類分析

將每個(gè)受試個(gè)體都單獨(dú)作為一個(gè)操作單元時(shí)，聚類分析首先在距離為1.1 的水平時(shí)將17 個(gè)雌性鉤蝠蛾蛹分為兩個(gè)大支(圖4A)，其中一支全部屬于色季拉鉤蝠蛾，另一支全部屬于蒲氏鉤蝠蛾，但蒲氏鉤蝠蛾的一支來自不同群體的個(gè)體交錯(cuò)排列、聚類混亂，說明數(shù)量形態(tài)標(biāo)記可在種間水平上取得較好的區(qū)分效果，但無法區(qū)分種內(nèi)的群體;20 個(gè)雄性鉤蝠蛾蛹的聚類結(jié)果與雌性相似(圖4B)，兩個(gè)物種在距離約1.5 水平時(shí)得以區(qū)分，但種下水平無法區(qū)分蒲氏鉤蝠蛾的兩個(gè)群體。

將每個(gè)群體作為一個(gè)操作單元時(shí)，無論雌雄的色季拉鉤蝠蛾都能在較高的距離水平上分支，蒲氏鉤蝠蛾的兩群相似性較高，雌性鉤蝠蛾的分支距離約0.7 (圖4C)，雄性鉤蝠蛾的分支距離約0.2 (圖4D)。

兩種聚類分析互為佐證，并且都支持了因子分析和主成分分析的結(jié)果。

2.4 判別分析

使用5 個(gè)測(cè)量形狀及一個(gè)比例性狀，對(duì)不同型的色季拉鉤蝠蛾進(jìn)行判別分類。首先根據(jù)3 個(gè)群體2 個(gè)性別將所有鉤蝠蛾分為6 型，通過判別分析分別得到6 型的判別公式并對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果如圖5A 及表3 所示，在種間水平及性別區(qū)分方面，判別的準(zhǔn)確率高達(dá)100%，但是在蒲氏鉤蝠蛾內(nèi)部?jī)扇旱姆直嫔铣霈F(xiàn)了判別錯(cuò)誤，東西部?jī)扇涸诖菩蹆尚陨隙即嬖诖罅總€(gè)體重疊，這導(dǎo)致了總體判別率的下降，但仍維持在約75%的高水平，由于不能達(dá)到95%以上的判別正確率，判別函數(shù)在此處未予展示。

蒲氏鉤蝠蛾東西兩群的相似度過高，考慮將其歸并，由此劃分出2種2 性別共計(jì)4 個(gè)型的鉤蝠蛾。逐步判別從6 個(gè)性狀中篩選出4 個(gè)特征建立判別公式如下:

T.sejilaensis ♀=570.94D+237.51W +437.79FL/PL+77.21FL-2763.86

T.sejilaensis=512.72D+222.56W +539.68FL/PL+59.67FL-2316.57

T.pui♀=675.69D +241.87W +464.88FL/PL+84.71FL-3514.81

T.pui=472.93D +337.90W +551.04FL/PL+72.70FL-2810.06

圖4 色季拉山鉤蝠蛾蛹的OUT 聚類分析圖Fig.4 Graphic of cluster analysis of Thitarodes pupae in Mt.Segrila

圖5 色季拉山鉤蝠蛾蛹判別分析圖Fig.5 Graphic of discriminant analysis of Thitarodes pupae in Mt.Segrila

將某個(gè)個(gè)體的4 個(gè)性狀的觀測(cè)值分別代入上述4 個(gè)公式，所得函數(shù)值最大者即為判別預(yù)測(cè)結(jié)果。據(jù)此對(duì)所有樣本按上述判別函數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分類并檢驗(yàn)，結(jié)果見表4，判別準(zhǔn)確率達(dá)到100%。同時(shí)通過考察其典型得分散點(diǎn)圖(圖5B)可知，4 型的鉤蝠蛾沒有任何個(gè)體的重疊，表明判別效果極好。

表3 6 型鉤蝠蛾蛹的判別分析結(jié)果Table 3 Discriminant results of six types of Thitarodes pupae in Mt.Segrila

表4 型鉤蝠蛾蛹的判別分析結(jié)果Table 4 Discriminant results of four types of Thitarodes pupaein Mt.Segrila

3 結(jié)論與討論

通過蛹的數(shù)量形態(tài)標(biāo)記可以快速便捷的辨別色季拉鉤蝠蛾與蒲氏鉤蝠蛾，并可確定標(biāo)本的性別，但無法區(qū)分蒲氏鉤蝠蛾的種下群體。在過往的研究中，大多數(shù)昆蟲物種及性別鑒定需要解剖并觀察成蟲的外生殖器(朱弘復(fù)等，2004)。而對(duì)于處于幼期的昆蟲，尤其是對(duì)于形態(tài)上較為相似、分布地點(diǎn)接近、生態(tài)位有較大重疊并且有相類的生活史和行為特征的物種來說，鑒定困難。同時(shí)，由于生殖系統(tǒng)的發(fā)育未至完全，幼期昆蟲的性別判定也殊為不易 (李德偉等，2008;趙琦等，2011;周英，2012;曹春雷等，2013;張蒙等，2014)。傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法，通常需要將幼蟲培養(yǎng)成成蟲后再進(jìn)行鑒定，整個(gè)過程長(zhǎng)達(dá)數(shù)周(朱振華等，2005)，而且需要豐富的經(jīng)驗(yàn)及專業(yè)知識(shí)。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記成為物種甚至種群區(qū)分的有利手段 (Voset al.，

1995;Vuylstekeet al.，2007;Chen et al.，2013)，其具備了較高的分辨率并可無視鑒定對(duì)象的發(fā)育階段，從不同的角度解釋進(jìn)化和分化，為諸多系統(tǒng)學(xué)和分類學(xué)研究做出較大貢獻(xiàn)(Behura，2006)。但分子標(biāo)記的成本相對(duì)較高，且其取樣往往涉及到樣本死亡或者破壞(Li et al.，2010)，在某些樣本獲取較困難的研究中，分子標(biāo)記的使用需要謹(jǐn)慎(解萌等，2008)。與分子生理及行為標(biāo)記等相比，形態(tài)特征在研究種群分化方面具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗亲匀贿x擇的具體體現(xiàn)(Garnier et al.，2005)，盡管分子生物學(xué)研究對(duì)物種分類提供了新的手段，但是借助多形態(tài)變量分析的形態(tài)學(xué)研究仍是主要研究手段(程承等，2012)。

本文的結(jié)果證明，在種間水平上，色季拉山分布的兩種鉤蝠蛾可通過5 個(gè)線性度量指標(biāo)簡(jiǎn)單區(qū)分。蒲氏鉤蝠蛾的蛹在縱向和橫向兩個(gè)維度上均大于色季拉鉤蝠蛾，這一點(diǎn)與其成蟲的體型比較結(jié)果一致(張古忍等，2007;Zou et al.，2011)。影響動(dòng)物體型大小的因素通常涉及到緯度與海拔(Chown and Gaston，2010)，貝格曼定律認(rèn)為動(dòng)物的體型會(huì)隨著緯度與海拔的上升而增大(Chown and Gaston，1999;Blanckenhorn and Demont，2004)。在本研究中，兩物種緯度接近，但色季拉鉤蝠蛾的海拔分布明顯高于蒲氏鉤蝠蛾(表1)(李峻峰，2011)，因此其體型比較的結(jié)果顯然與貝格曼定律是相悖的，這種“反貝格曼”分布在其他的昆蟲體型研究中也有很多報(bào)道(Chown and Gaston，2010)。兩種理論爭(zhēng)議的焦點(diǎn)主要集中在緯度分布數(shù)十度、海拔落差數(shù)百米內(nèi)的小范圍分布物種，而在大尺度上大部分物種仍然服從于貝格曼定律(Gaston et al.，2008)。因此，在色季拉山范圍內(nèi)分布的兩種鉤蝠蛾其分布應(yīng)屬于“反貝格曼”分布，而青藏高原的鉤蝠蛾屬其體型分布的趨勢(shì)可能仍然為隨著海拔升高而增大，但這一點(diǎn)仍需要更多的研究和數(shù)據(jù)支持。

在種內(nèi)水平，蒲氏鉤蝠蛾兩種群無法區(qū)分，這進(jìn)一步證明了蛹的數(shù)量形態(tài)在種內(nèi)的穩(wěn)定性，支持了使用本研究結(jié)果進(jìn)行物種鑒定的可靠性。同時(shí)，本研究涉及的兩個(gè)物種都呈現(xiàn)出明顯的種內(nèi)性體型二型現(xiàn)象，雌性體型均顯著大于雄性體型，這符合大部分昆蟲的性別二態(tài)性(Chown and Gaston，2010)，通常認(rèn)為，昆蟲雌性較雄性更為復(fù)雜的生殖系統(tǒng)是造成上述現(xiàn)象的原因(Fairbairn，2005)。在本研究中，雌性蛹都有著相對(duì)較長(zhǎng)的后部，而雄性蛹的后部均與前部長(zhǎng)度接近，其原因可能在于雌性蛹的后部對(duì)應(yīng)著羽化后成蟲的腹部即生殖中心，而蛹階段的鉤蝠蛾生殖系統(tǒng)已發(fā)育接近完善，雌性蛹需擁有更大的后部空間用以容納復(fù)雜的生殖管道，但這一點(diǎn)也需要更加深入的研究加以證明。

本研究的結(jié)果與過往研究中使用線粒體分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果相符:mtDNA 的3 個(gè)基因序列(COⅠ、COⅡ、Cytb)在蒲氏鉤蝠蛾的不同種群中均無顯著差異，表現(xiàn)出較為單一的單倍型狀態(tài)(鄒志文，2009;喻浩，2013)，在種內(nèi)的保守性較強(qiáng);3 個(gè)基因序列在種上水平雖然差異程度不一，但都能明顯區(qū)分色季拉山的兩種鉤蝠蛾(Li et al.，2010;喻浩，2013)。因此，本文使用形態(tài)標(biāo)記進(jìn)一步支持了分子標(biāo)記的結(jié)果，兩種方法互為佐證，在對(duì)兩種鉤蝠蛾的種間差異的檢測(cè)上，形態(tài)數(shù)量標(biāo)記的分辨率完全能達(dá)到要求。若研究鉤蝠蛾昆蟲不同地理種群的種群分化、遺傳變異與鑒別，需要檢測(cè)到種下水平時(shí)，則還需探索其他更高分辨率或?qū)蚪M覆蓋面更廣的分子標(biāo)記如AFLP、RAPD 等(Excoffier et al.，2009)。

本研究還得到了色季拉山鉤蝠蛾蛹的數(shù)量形態(tài)判別公式，4 個(gè)判別式分別對(duì)應(yīng)了兩個(gè)物種的兩個(gè)性別，并且其判別準(zhǔn)確率均達(dá)到了100%。一般認(rèn)為，準(zhǔn)確率在95% 以上的判別公式效果極好(易丹輝，2002)，很多使用判別分析的研究中準(zhǔn)確率約為60%-80% (劉達(dá)博等，2009;羅會(huì)等，2013)。雖然本研究受限于樣本量，可能在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)降低準(zhǔn)確率，但目前的結(jié)果仍足以作為個(gè)體鑒定的參考。在色季拉山得到一個(gè)新的鉤蝠蛾蛹個(gè)體，無法判定其性別和種類時(shí)，測(cè)量其厚度D、寬度W、前后部的長(zhǎng)度并計(jì)算其比值FL/PL，將數(shù)據(jù)帶入4 個(gè)判別式中計(jì)算并比較，取值最大者即為其性別和所屬種類。當(dāng)然，最可靠的鑒定結(jié)果仍需要觀察其羽化后的成蟲，使用一種統(tǒng)計(jì)方法作為物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)仍然具有其自身的缺陷和不確定性，但其也不失為一種有利的輔助手段。另外，大部分的鉤蝠蛾屬昆蟲都具有與色季拉山種類相似的特點(diǎn)，分布范圍狹小而擴(kuò)散能力弱(楊大榮，1997)，這限制了其種內(nèi)的變異，使其形態(tài)尤其是數(shù)量特征趨于穩(wěn)定，客觀造成了種間變異遠(yuǎn)大于種內(nèi)變異的現(xiàn)狀。這也解釋了為何在青藏高原還能不斷的發(fā)現(xiàn)鉤蝠蛾屬新種(楊大榮等，1996;張古忍等，2007)?；谶@一現(xiàn)象，本文使用的方法可考慮推廣，用以辨別分布地點(diǎn)較為接近甚至生境重疊的其他鉤蝠蛾種類。

綜上所述，色季拉山的兩種鉤蝠蛾，其蛹的體型存在著較大的種間變異和較小而種內(nèi)變異，主要表現(xiàn)在蛹長(zhǎng)度、寬度、厚度及蛹前后長(zhǎng)度比值這些特征上。依此現(xiàn)象，可建立數(shù)量判別方法用以快速辨別蛹的種類和性別。在青藏高原特殊復(fù)雜的生境和氣候條件下，鉤蝠蛾的變異和分化的原因是值得進(jìn)一步研究的問題。

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