亞洲玉米螟幾丁質(zhì)合成酶B (CHSB)啟動(dòng)子序列克隆與分析

楊 晨 ，魯 新，王振營，席景會(huì)，潘怡歐，畢 銳，彭天飛，尚慶利*

(1.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，吉林公主嶺 136100;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100186)

亞洲玉米螟是一種主要為害玉米的重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要分布在亞洲東部和澳洲(王振營等，2000)。其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，生活的緯度跨越大，能夠適應(yīng)從潮濕到干旱、寒冷到炎熱的絕大部分地區(qū)。因?yàn)榧闹鞑煌蜕畹沫h(huán)境不同，亞洲玉米螟相應(yīng)的生長狀態(tài)，如體重、大小、年發(fā)生代數(shù)都不盡相同(杜益哉和楊顧新，1985;謝為民，1989;胡明峻和孫伯欣，1979)。在我國，亞洲玉米螟主要分布在北至黑龍江，南至廣東的廣大區(qū)域。亞洲玉米螟寄主極為廣泛，除取食玉米外，還侵害包括常見的農(nóng)作物有水稻、棉花、高粱、谷子等幾十種不同的農(nóng)作物(王振營等，2000)。防治亞洲玉米螟通常采用化學(xué)農(nóng)藥、選育抗性品種和天敵防治的方法。近年來，生物技術(shù)得到長足發(fā)展，也為玉米抗螟品種的培育提供了新的方法。例如將Bt 毒蛋白基因和蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入玉米從而分別得到轉(zhuǎn)基因作物(丁群星等，1993;王國英等，1995)。但推廣轉(zhuǎn)基因作物困難重重，再加上傳統(tǒng)化學(xué)防治的過程中，亞洲玉米螟又會(huì)不斷的產(chǎn)生抗性。因此，亟待尋找一種新型的環(huán)境友好型的防治亞洲玉米螟的方法。昆蟲幾丁質(zhì)合成酶是昆蟲蛻皮和變態(tài)發(fā)育過程中幾丁質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是潛在的環(huán)境友好殺蟲劑的理想靶標(biāo)。

幾丁質(zhì)是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)以β-1，4 糖苷鍵連接而成的線性多糖。幾丁質(zhì)在真菌、線蟲和節(jié)肢動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)，而昆蟲幾丁質(zhì)是昆蟲體壁與中腸的圍食膜的重要組成成分，圍食膜可以保護(hù)昆蟲減少食物以及入侵微生物對中腸造成的機(jī)械損害(Hegedus et al.，2009)。

幾丁質(zhì)的形成大致可分為三個(gè)不同的步驟(Merzendorfer，2006)。在第一步驟中，酶催化結(jié)構(gòu)域形成聚合物;第二個(gè)步驟，新生的聚合物通過膜轉(zhuǎn)移并釋放到細(xì)胞外空間;最后一步完成單聚合物自發(fā)組裝形成結(jié)晶微纖維。在隨后的反應(yīng)中微纖維與其他糖類、蛋白質(zhì)、糖蛋白結(jié)合形成真菌隔膜和細(xì)胞壁以及節(jié)肢動(dòng)物的角質(zhì)層和圍食基質(zhì)。這個(gè)過程在甲殼綱動(dòng)物和昆蟲中最為常見。幾丁質(zhì)合成酶與幾丁質(zhì)的合成密切相關(guān)，它屬于糖基轉(zhuǎn)移酶的第二家族。幾丁質(zhì)的合成需要UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)作為底物和二價(jià)陽離子作為輔因子。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)合成酶共有兩種，它們分別是幾丁質(zhì)合成酶A (CHSA)、幾丁質(zhì)合成酶B (CHSB)(Merzendorfer，2006)。這兩種酶的基本屬性非常相似，分子量都在170 kDa 左右，都包含有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域:N-末端跨膜結(jié)構(gòu)域，一個(gè)中央催化結(jié)構(gòu)域和C-末端跨膜結(jié)構(gòu)域。不同之處在于，CHSB 比CHSA 略短，具有較低的等電點(diǎn)，因此編碼的蛋白質(zhì)也略小一些。它們功能表達(dá)的區(qū)域也并不相同，CHSA 主要合成昆蟲表皮的幾丁質(zhì)(Arakane et al.，2008)，而CHSB 在圍食膜的形成階段表達(dá)(Arakane et al.，2005;Bolognesi et al.，2005;Kumar et al.，2008)。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)抑制CHSB 合成幾丁質(zhì)的表達(dá)時(shí)，昆蟲將會(huì)因?yàn)轲囸I而導(dǎo)致死亡(Arakane et al.，2005)。本研究考慮通過研究CHSB 基因的啟動(dòng)子，找出控制亞洲玉米螟中腸圍食膜幾丁質(zhì)合成酶表達(dá)的核心元件，并分析該基因可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，尋找可能的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

收集實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)的亞洲玉米螟3 齡幼蟲，經(jīng)液氮處理后凍入-80℃冰箱。

1.2 亞洲玉米螟基因組DNA 的提取以及前期準(zhǔn)備

利用DNAiso Reagent (TaKaRa)試劑盒提取亞洲玉米螟基因組DNA。用6種不同的平末端內(nèi)切酶(BstZ17I、PmeI、PsiI、PvuII、SmaI、SnaBI、StuI)分別消化基因組DNA。然后，再將消化后的片段按照DNA Genome WalkerTMUniversal Kit (Clonech)的步驟進(jìn)行純化。最后，我們將已純化的DNA 片段分別連接上接頭引物。

1.3 染色體步移引物的設(shè)計(jì)及目的片段的PCR擴(kuò)增

依據(jù)亞洲玉米螟 B 型幾丁質(zhì)合成酶(OfCHSB)序列(GeneBank ID:DQ 294306)設(shè)計(jì)兩個(gè)反 特異性 物 GSP1 (5'-GTGATGAAGAGCAGGGTGCCTTTACA-3') 和GSP2 (5'-TTTCAGTATCGGATTCATCGCTGTCAC-3')，分別與用引 AP1 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3')、AP2 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3')配對使用。染色體步移總共需要進(jìn)行兩輪PCR 反應(yīng)，以AP1、GSP1為引物進(jìn)行第一輪PCR，然后以第一輪PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍為模板，AP2、GSP2 為引物進(jìn)行第二輪特異性PCR 擴(kuò)增。PCR 程序參考試劑盒說明書。

1.4 目的DNA 的pGEM-Teasy 載體連接與轉(zhuǎn)化

以不同內(nèi)切酶處理獲得的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并回收目的片段，回收產(chǎn)物與pGEM-Teasy 載體連接、轉(zhuǎn)化。選取陽性單克隆37℃擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體步移法擴(kuò)增未知序列

用設(shè)計(jì)好的特異引物和處理好的玉米螟DNA進(jìn)行兩輪特異性PCR，目的產(chǎn)物被特異性擴(kuò)增。第二輪PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，只有經(jīng)過平末端內(nèi)切酶BstZ17I 處理后的DNA 片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在1 kb 和2 kb 之間得到一條特異性條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示該DNA 片段為OfCHSB 基因5'端側(cè)翼序列。

圖1 染色體步移法第二輪PCR 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis of the second round PCR of genome walker

2.1 OfCHSB 啟動(dòng)子序列及分析

用啟動(dòng)子分析軟件 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析了啟動(dòng)子的核心元件及可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用在線軟件(http://www.fruitfly.org/seq_ tools/promoter.html)預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在序列表中，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基用+1 示出，起始密碼子ATG 用加粗標(biāo)注。測序結(jié)果顯示，從BstZ17I 消化后的DNA 中擴(kuò)增得到1484 bp 的DNA 片段，分析顯示該片段為OfCHSB 基因5'端序列。其中，OfCHSB 的開放閱讀框從+348 開始，啟動(dòng)子包含的序列是﹣1082 至+347，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)從+1 開始。如圖所示，通過分析顯示6種轉(zhuǎn)錄因子(GATA-1、C/EBPalpha、Oct-1、Dfd、CREB、ER)可能參與OfCHSB 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其在DNA 上的結(jié)合位點(diǎn)如圖所標(biāo)示。+116 至+127 (CREB)、+120至+131 (ER)和+292 至+302 (Oct-1)區(qū)域可能是該啟動(dòng)子的核心順式元件。

DNA 序列區(qū)域+348 至+402 (粗體)是OfCHSB 基因5'端的編碼區(qū)，-1082 至+1 是OfCHSB 基因啟動(dòng)子序列。+1 表示OfCHSB 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，標(biāo)注有下劃線的序列是可能的啟動(dòng)子上的順式元件(見圖2)。

3 結(jié)論與討論

亞洲玉米螟幾丁質(zhì)合成酶的研究中，CHSA 很可能存在兩個(gè)通過選擇性剪接的異構(gòu)體，即OfCHSA-2a 和OfCHSA-2b (Qu and Yang，2011)，它們分別受兩個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子控制。其中OfCHSA-2a 在玉米螟生長和發(fā)展階段起作用，主要是在幼蟲-幼蟲蛻皮和幼蟲-蛹轉(zhuǎn)化，以及在產(chǎn)卵期間表達(dá)，而OfCHSA-2b 僅在幼蟲-幼蟲蛻皮時(shí)表達(dá)。由此可見啟動(dòng)子對昆蟲幾丁質(zhì)合成酶的產(chǎn)生有很大的影響。

在昆蟲生長的不同時(shí)期，產(chǎn)生幾丁質(zhì)合成酶的過程受到啟動(dòng)子的調(diào)控。CHSB 在圍食膜的形成階段表達(dá) (Arakane et al.，2005;Kumar et al.，2008)。當(dāng)抑制CHSB 合成幾丁質(zhì)的表達(dá)時(shí)，昆蟲將會(huì)因?yàn)轲囸I而導(dǎo)致死亡(Arakane et al.，2005)。假如能夠找出控制昆蟲生長發(fā)育過程當(dāng)中至關(guān)重要的基因上的啟動(dòng)子中核心元件，就有可能找到一種抑制該啟動(dòng)子活性的安全快捷的方法，從而為開發(fā)基于該策略的亞洲玉米螟防治新方法提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中，我們用染色體步移方法得到了全長接近1500 bp 的OfCHSB 5'端側(cè)翼序列，預(yù)測了OfCHSB 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并分析了該基因啟動(dòng)子的核心元件及可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。分析顯示6種轉(zhuǎn)錄因子(GATA-1、C/EBPalpha、Oct-1、Dfd、CREB、ER)可能參與OfCHSB 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在家蠶BmUSP 基因中，轉(zhuǎn)錄因子Dfd 能夠調(diào)控該基因合成蛻皮激素，從而對家蠶的發(fā)育產(chǎn)生影響(Huang et al.，2014)。CREB 是一種亮氨酸拉鏈因子(bZIP)，亮氨酸拉鏈?zhǔn)堑鞍踪|(zhì)中一種常見的三維結(jié)構(gòu)模體，常見于許多轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此涉及基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，在果蠅Myc 基因中的CREB 能夠調(diào)控該基因表達(dá)起到抑制多聚谷氨酰胺蛋白的毒性的作用，并可以被用來作為一種潛在的藥物靶標(biāo)作用于多聚谷氨酰胺疾病(Singh et al.，2014)。ER 是鋅指蛋白(Zinc finger)的一種，鋅指是在很多蛋白中存在的一類具有指狀的結(jié)構(gòu)模體，這些具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白大多都是與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)的功能蛋白。在對東亞飛蝗的研究中，存在于LmSPC1 基因上的ER I 型信號肽酶亞基對東亞飛蝗的生存至關(guān)重要，影響其蛻皮、取食、生殖和胚胎發(fā)育等諸多方面。因此，該ER 轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控LmSPC1 基因的表達(dá)(Zhang et al.，2014)。Oct-1 是含有POU 結(jié)合域的一種轉(zhuǎn)錄因子并參與目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，同屬于POU 結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)同源異構(gòu)型轉(zhuǎn)錄因子Oct-1 和Oct-2 能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控雞免疫球蛋白基因的表達(dá)，從而影響其免疫功能 (Petryniak et al.，1990)。結(jié)合Dfd、CREB、ER、Oct-1 在不同生物體中對相關(guān)基因發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，我們可以推測在亞洲玉米螟OfCHSB 基因中，這些結(jié)合位點(diǎn)同樣可能起著轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。對該啟動(dòng)子序列分析表明，該序列包含了完整的啟動(dòng)子序列和OfCHSB 序列5' 端的一段序列，這是一個(gè)新的亞洲玉米螟OfCHSB 的啟動(dòng)子序列。曾有研究人員獲得了約500 bp 的亞洲玉米螟OfCHSB 啟動(dòng)子序列(Qu et al.，2011)，但與本研究得到的啟動(dòng)子序列并不完全一致，這有可能是編碼同一種蛋白的不同拷貝型?；谶@段完整的啟動(dòng)子序列和預(yù)測得到的啟動(dòng)子核心元件，我們可以進(jìn)一步進(jìn)行該序列的功能驗(yàn)證并找出其調(diào)控途徑，從而為亞洲玉米螟的防治提供理論依據(jù)。

圖2 OfCHSB 基因啟動(dòng)子和部分5' 端的編碼區(qū)序列Fig.2 OfCHSB promoter and part of the 5 ' end of the coding sequence

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