桔小實(shí)蠅超氧化物歧化酶基因SOD3的克隆及表達(dá)分析

申建梅，陳炳翰，李 森，廖泓之，柯 智，柳建良，胡黎明

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)系，廣州 510225)

生物體多種生理代謝中都會(huì)生成一種超氧陰離子自由基(·O2)-的中間產(chǎn)物。(·O2)-是活性氧的一種，具有極強(qiáng)的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，EC1.15.1.1，SOD)是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子(Bannister et al.，1987)。該酶是一種含有金屬元素的蛋白酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)。SOD 按照與其結(jié)合的金屬輔基的不同，主要可分為3種，分別為:Cu/Zn SOD、Mn SOD、Fe SOD (Weisiger and Fridovich et al.，1973)。在生物體內(nèi)，SOD 把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫后，進(jìn)一步在過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的作用下分解為完全無害的水而使生物細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白、脂質(zhì)等生物大分子免受損害(Fridovich，1995)。因此，SOD 在昆蟲的生命活動(dòng)中具有重要作用，對(duì)其開展深入研究可為害蟲控制提供新的作用靶標(biāo)。

桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis (Hendel)屬雙翅目Dipter 實(shí)蠅科Tetriphitedae，該蟲主要危害番石榴、藍(lán)莓、楊桃、桃、芒果、柑桔、李、枇杷等多種水果(Alyokhin et al.，2001;Nakahara et al.，2008)。目前，桔小實(shí)蠅的防治主要以化學(xué)農(nóng)藥為主，但目前桔小實(shí)蠅已對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性，并且化學(xué)農(nóng)藥也對(duì)水果的品質(zhì)造成了嚴(yán)重的影響(Hsu and Feng，2000)。因此，尋找新的藥物作用靶標(biāo)，設(shè)計(jì)新型桔小實(shí)蠅控制劑是減少化學(xué)農(nóng)藥使用進(jìn)而提高水果品質(zhì)的重要措施之一。

為更好地從分子生物學(xué)角度研究Cu/Zn SOD基因在桔小實(shí)蠅生命活動(dòng)中的重要作用，本研究在從噬菌體文庫獲得桔小實(shí)蠅Cu/Zn SOD 部分核苷酸序列的基礎(chǔ)上，克隆獲得桔小實(shí)蠅Cu/Zn SOD基因序列，采用半定量分析方法分析大腸桿菌對(duì)Cu/Zn SOD 表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示了桔小實(shí)蠅Cu/Zn SOD 的生理功能，本結(jié)果將為設(shè)計(jì)以Cu/Zn SOD 蛋白為靶標(biāo)的桔小實(shí)蠅控制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 桔小實(shí)蠅由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用人工飼料飼養(yǎng) (袁盛勇等，2006)。

1.1.2 試劑 RNA 提取試劑盒(6733-2)購于Omega 公司，5'-RACE 試劑盒購于Invitrogen 公司，pMD20-T 克隆載體、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、ExTaq DNA 聚合酶及SYBR Premix ExTaq 熒光試劑，均購于TaKaRa 公司，核酸瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于Tiangen 公司。

1.2 桔小實(shí)蠅RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

按照RNA 提取試劑盒使用說明提取桔小實(shí)蠅不同發(fā)育時(shí)期的總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后，按照反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)說明書以O(shè)ligo-dT (引物序列見表1)為引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此作為PCR 和熒光定量PCR 反應(yīng)的模板。

1.3 BdorSOD 基因的克隆及序列分析

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)噬菌體文庫中測(cè)序得到的BdorSOD 基因的EST 序列(該序列為ORF 的中間序列)，設(shè)計(jì)2 條基因特異引物(B-SOD-51和B-SOD-52)(序列見表1)，分別與GeneRacer 5'Primer 和GeneRacer 5' Nested Primer搭配，用以擴(kuò)增BdorSOD 基因5'端序列;再根據(jù)序列拼接結(jié)果設(shè)計(jì)1 條特異性引物(B-SOD31)(序列見表1)與Oligo-dT 搭配，用于擴(kuò)增BdorSOD 基因的3'序列。所有引物均由廣州英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增與RACE 反應(yīng) 以合成的cDNA為模板，加入10×ExTaq 聚合酶反應(yīng)緩沖液5 μL(含Mg2+)，正向和反向引物各1 μL (10 μmol/L)，dNTP 4 μL (2.5 mmol/L)，ExTaq DNA 聚合酶0.25 μL (5 U/μL)，加ddH2O 至50 μL，輕微渦旋混勻并離心(3000 rpm/min，5 s)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性3 min;94℃30 s，61℃45 s，72℃1 min 34 個(gè)循環(huán)，循環(huán)完畢后，72℃保溫10 min。RACE 反應(yīng)體系及程序參照試劑盒說明書。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

PCR 及RACE 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接到pMD-20 載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，經(jīng)氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA，交由廣州英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用Blast 在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，采用Megalign 程序中的Jotun Hein方法進(jìn)行序列進(jìn)化關(guān)系分析。

1.4 大腸桿菌誘導(dǎo)前后的半定量分析

桔小實(shí)蠅化蛹48 h 后，采用Dang 等人的方法用大腸桿菌Escherichia coli DH5α 感染誘導(dǎo)。處理24 h、48 h 后取樣，樣品迅速置液氮中冷卻后保存于-80℃冰箱備用。以桔小實(shí)蠅actin 基因?yàn)閰⒄栈?擴(kuò)增引物見表1 BactF 、BactR)對(duì)大腸桿菌感染引起的SOD 基因(擴(kuò)增引物見表1，SOD ORF1 及SOD ORF2)表達(dá)量變化進(jìn)行半定量分析。

1.5 BdorSOD 蛋白三維結(jié)構(gòu)建模

采用SWISS-MOLDLE 軟件對(duì)BdorSOD 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的模建(Arnold et al.，2006)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BdorSOD 基因的克隆及序列分析

根據(jù)噬菌體文庫中測(cè)序得到的BdorSOD 基因的EST 序列設(shè)計(jì)2 條特異引物分別與試劑盒中的5'RACE 引物搭配進(jìn)行槽式擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后得到450 bp 左右的特異條帶，將測(cè)序結(jié)果拼接后得到BdorSOD 基因的cDNA5'序列。以B-SOD31和Oligo-dT 為引物，擴(kuò)增獲得BdorSOD 基因的3'序列，該基因ORF 全長(zhǎng)531 bp，編碼176 個(gè)氨基酸(圖1)，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白分子質(zhì)量約為18.348 kD，等電點(diǎn)為6.45，第1-20 位氨基酸為其信號(hào)肽區(qū)域。BdorSOD 序列含有SOD 蛋白的特征序列 (圖1 中用陰影框進(jìn)行了標(biāo)示)，如GFHVHEEGDLT (68-78 位氨基) 及GNAGGRLACQVI (162-173 位氨基酸);70，72，87，144 位的4 個(gè)組氨酸為Cu 離子結(jié)合位點(diǎn)(圖中用空心的三角框標(biāo)示)，87，95，104 位的3 個(gè)組氨酸及107 位的天冬氨酸(用空心圓圈標(biāo)示)為蛋白的Zn 離子結(jié)合位點(diǎn)。

根據(jù)SOD 蛋白結(jié)合的金屬離子的不同，可將其分為Cu/Zn SOD、Mn SOD、Fe SOD 三類。Cu/Zn SOD 又分為胞內(nèi)SOD 與胞外SOD 兩類。本研究結(jié)合前期工作中克隆到的胞內(nèi)SOD (本文命名為SOD1 Bactrocera dorsalis)，分別選取昆蟲及脊椎動(dòng)物SOD 序列，采用Megalign 軟件中的Jotun Hein 方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2。

圖1 BdorSOD3 ORF 區(qū)域及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.1 The ORF region of BdorSOD3 and the deduced amino acid sequences

圖2 不同物種SOD 蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic relationship of SOD protein in different species

由圖2 可知，29 條來自雙翅目、膜翅目昆蟲及部分脊椎動(dòng)物的SOD 序列，可聚為I 和II 兩個(gè)大類。I類中主要為胞內(nèi)SOD類，II類中主要為胞外SOD類蛋白。前期工作中的桔小實(shí)蠅SOD1 及本研究中的BdorSOD3 分別聚到第I、II 大類中。各類中大多數(shù)序列的聚類關(guān)系與昆蟲的分類地位表現(xiàn)出較高的一致性。序列一致性分析表明，BdorSOD3 與胞外SOD 的序列一致性超過50%，被聚到第II 大類中;與桔小實(shí)蠅AGE89778.1 的序列的一致性最高，達(dá) 98.7%，與搖蚊序列AFM78035.1 的一致性值為50.9%。

2.3 BdorSOD3 蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬

通過對(duì) PDB 庫比對(duì)，BdorSOD3 與菠菜Spinach 中的Cu/Zn SOD 蛋白1 srd 的一致性最高，進(jìn)一步以二聚體的1 srd 為模版，構(gòu)建了BdorSOD3的三維結(jié)構(gòu)，獲得了的BdorSOD3 二聚體的模建結(jié)構(gòu)(圖3)。

由圖3A 可知BdorSOD3 蛋白的三維結(jié)構(gòu)主要由β 片層構(gòu)成。兩個(gè)亞基聚成二聚體后，β 片層形成“V”型的鉗狀結(jié)構(gòu)(圖3B 虛線所示)。

圖3 BdorSOD3 的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.3 Three-dimensional model of BdorSOD3

2.4 BdorSOD3 基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

用大腸桿菌(E.coli DH5α)誘導(dǎo)處理2 d 蛹，對(duì)處理后24、48 h 的BdorSOD3 的表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，結(jié)果如圖4。由圖4 可見，actin 基因的表達(dá)量在處理及未處理樣本中的表達(dá)量大致相當(dāng)(泳道1-4)，而BdorSOD3 在處理后24 h，其表達(dá)量略有升高(泳道7)，而處理后48 h 的表達(dá)量明顯升高(泳道8)。

圖4 大腸桿菌處理后24、48 h BdorSOD3 的表達(dá)量分析Fig.4 Relative amount of BdorSOD3 mRNA in 24 and 48 hours pupa treated with Escherichia coli DH5α

3 結(jié)論與討論

哺乳動(dòng)物中的Cu/Zn SOD 按照其在細(xì)胞及細(xì)胞器中的位置分為胞內(nèi)型 (SOD1)和胞外型(SOD3)兩類。SOD3 在功能、結(jié)構(gòu)上與SOD1 相似，但在SOD3 的 N 端往往包含一段信號(hào)肽(Okado-Matsumoto and Fridovich，2001;Stenlund et al.，2002)。本研究結(jié)合前期噬菌體文庫的研究結(jié)果，進(jìn)一步采用RACE 技術(shù)克隆獲得一種桔小實(shí)蠅SOD 基因。該蛋白N 端含有20 個(gè)氨基酸信號(hào)肽，屬于胞外型SOD，故將其命名為BdorSOD3。

Colinet 等(2011)對(duì)果蠅兩種寄生蜂的毒液器官(venom apparatus)中發(fā)現(xiàn)的SOD 蛋白與部分膜翅目昆蟲的SOD 蛋白進(jìn)行序列聚類分析表明胞內(nèi)型與胞外型具有較遠(yuǎn)的遺傳距離。本研究聚類結(jié)果顯示，第I 和II 大類中均包含了雙翅目、膜翅目昆蟲及部分脊椎動(dòng)物的SOD 蛋白。聚類結(jié)果中，昆蟲及脊椎動(dòng)物的胞內(nèi)和胞外型SOD 序列分別被聚到I、II 兩個(gè)不同的大類中，在每個(gè)大類中序列的相似性與其分類地位具有較好的一致性，表明胞內(nèi)和胞外型SOD 在物種進(jìn)化的早期已經(jīng)發(fā)生進(jìn)化分離。

昆蟲主要依靠其自身的天然免疫來抵御各種病原物的入侵(Leulier and Lemaitre，2008)。昆蟲的天然免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫，細(xì)胞免疫依賴血細(xì)胞對(duì)外來異物進(jìn)行吞噬和包囊，而體液免疫則是以抗菌肽、凝集素、溶菌酶及酚氧化酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)等發(fā)揮作用(Lazzaro，2008)。研究表明，桔小實(shí)蠅4 日齡幼蟲被長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂寄生后，體內(nèi)SOD、POD、CAT 等抗氧化酶的活性明顯提高(王勇等，2013)。黨向利等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌感染處理桔小實(shí)蠅的蛹，會(huì)誘導(dǎo)蛹內(nèi)抗菌肽的表達(dá)(黨向利等，2012)。而本研究表明，在大腸桿菌處理后48 h BdorSOD3 的表達(dá)量明顯升高，暗示BdorSOD3 與桔小實(shí)蠅蛹對(duì)外界微生物的免疫機(jī)制有關(guān)，但其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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