溝眶象體內(nèi)感染的Wolbachia 的wsp 基因克隆與序列分析

高 朋，劉振凱，溫俊寶

(北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

Wolbachia 是廣泛分布于昆蟲細(xì)胞內(nèi)的一類細(xì)胞內(nèi)共生菌(Werren et al.，2008)。在16%的昆蟲體內(nèi)檢測(cè)到Wolbachia 的存在，其中包括鞘翅目、雙翅目、半翅目、鱗翅目、直翅目及膜翅目(Werren et al.，1995;West et al.，1998)。通過(guò)長(zhǎng)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)發(fā)現(xiàn)76%的節(jié)肢動(dòng)物感染W(wǎng)olbachia(Jeyaprakash et al.，2000)。說(shuō)明Wolbachia 可能是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的共生細(xì)菌中感染寄主最為豐富的類群。Wolbachia 對(duì)寄主昆蟲的主要影響有孤雌生殖、細(xì)胞質(zhì)不親和、雌性化、殺雄作用?；赪olbachia的對(duì)寄主昆蟲的這些影響，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量相關(guān)研究，主要集中在分類地位(van Meer et al.，1999;Jeyaprakash et al.，2000)，感染率(馮宏祖等，2014)，生殖調(diào) 控 (陸明紅，2011)，Wolbachia 的多重感染(李菁等，2010)等方面。

目前對(duì)于Wolbachia 的系統(tǒng)發(fā)育分析主要通過(guò)wsp、ftsZ、16S rDNA、gltA、groEL 等基因進(jìn)行。Wolbachia 的系統(tǒng)發(fā)育分析早期主要通過(guò)16S rDNA基因進(jìn)行，并對(duì)Wolbachia 進(jìn)行分類，隨后的研究表明16S rDNA 基因的進(jìn)化速度比較慢，不適用于Wolbachia 的多樣性進(jìn)行精細(xì)的分類研究(Stouthmaer et al.，1993)。逐漸采 ftsZ 對(duì)Wolbachia 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，因?yàn)槠溥M(jìn)化較快(Schilhutizen et al.，1998)。基于ftsZ 的系統(tǒng)發(fā)育研究，Wolbachia 可分為A-F 的6 個(gè)組 (Lo et al.，2002)。昆蟲感染的Wolbachia 主要屬于A 組和B 組，并通過(guò)wsp 基因?qū) 組和B 組進(jìn)行了細(xì)分。Zhou 等 (1998)認(rèn)為A 組包括Mel、AlbA、Riv、Mors、Uni、Pap、Haw 和Aus 8 個(gè)亞群，B 組包括Dei、Con、Pip 和CauB 4 個(gè)亞群。通過(guò)進(jìn)一步 究 van Meer 等 (1999) 和Jeyaprakash 等(2000)將A、B 群進(jìn)進(jìn)一步細(xì)分為10 亞群、11 亞群。

溝眶象Eucryptorrhynchus chinensis (Olivier)主要危害臭椿樹Ailanthus altissima (Mill.)及其變種千頭椿Ailanthus altissima var.qiantouchun (楊貴軍等，2008)。在中國(guó)北方城市臭椿樹作為常用的行道樹，伴隨著種植面積的擴(kuò)大，近年來(lái)溝眶象的危害越來(lái)越嚴(yán)重。目前對(duì)溝眶象的生物學(xué)特性和生理生化等方面已經(jīng)進(jìn)行了較多研究(雍惠莉等，2007;楊貴軍等，2008)。溝眶象幼蟲主要在地面以下活動(dòng)，危害臭椿的根部，化學(xué)防治存在一定困難(于倩倩等，2012)。Wolbachia 能調(diào)控昆蟲的生殖，對(duì)溝眶象的防治可能存在一定幫助。目前尚無(wú)有關(guān)溝眶象體內(nèi)Wolbachia 的報(bào)道。本文對(duì)溝眶象是否感染 Wolbachia;如果感染W(wǎng)olbachia，對(duì)感染的Wolbachia 的分類地位，通過(guò)wsp 基因進(jìn)行判斷和分析，為進(jìn)一步研究Wolbachia對(duì)溝眶象生殖的調(diào)控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

溝眶象分別采集于寧夏靈武、中寧、中衛(wèi)，山東聊城，安徽淮北。所有樣本均用95%酒精保存，置于-20℃待用。

1.2 試劑

基因組DNA 提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，DNA 克隆試劑盒及PCR 所用的各種試劑均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。試驗(yàn)中所使用引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 溝眶象DNA 總提

分別采用單頭相應(yīng)試蟲，利用基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒加入GA 緩沖液充分研磨，使昆蟲組織破碎，配置成細(xì)胞懸浮液，提取試驗(yàn)用蟲的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性。將DNA 模板置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 溝眶象體內(nèi)的Wolbachia 的wsp 基因的擴(kuò)增

擴(kuò)增使用Wolbachia 的wsp 基因片段的通用引物81F (5'-TGGTCCAATAAGTGAT GAAGAAAC-3')和691R (5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3')(Zhou 等，1998)。PCR 反應(yīng)體系體積為25 μL，其中2×Power Taq PCR MasterMix (北京天)12.5 μL，DNA 模板1 μL，10 nmol/L 上下游引物各1 μL，滅菌水9.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，48℃退火45 s，72℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán);最后72℃總延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 序列測(cè)定與分析

將目的基因wsp 片段的PCR 產(chǎn)物回收、純化，然后與pGM-T 載體連接，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌TOP-10 菌株中，篩選陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑選3 個(gè)克隆，委托北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。每個(gè)種群隨機(jī)選取20 個(gè)個(gè)體對(duì)其體內(nèi)的Wolbachia 進(jìn)行檢測(cè)，然后對(duì)wsp 基因進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總提DNA 的檢測(cè)

溝眶象的總提DNA 通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 進(jìn)行檢測(cè)，DNA 條帶清晰，無(wú)拖尾彌散現(xiàn)象，OD260/OD280均在1.8 左右。表明DNA 純度較高，可用克隆與檢測(cè)。

2.2 溝眶象體內(nèi)Wolbachia 的感染情況

通過(guò)使用Wolbachia 的wsp 基因通用引物對(duì)5 個(gè)種群的個(gè)體的腹部總提NDA 進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)種群每個(gè)個(gè)體都都擴(kuò)增出一條593 bp 的片段，證實(shí)了溝眶象每個(gè)種群都感染了Wolbachia，而且感染率為100% (表1)。

表1 溝眶象5 個(gè)地理種群的Wolbachia 檢測(cè)Table 1 Wolbachia infection of five populations of Eucryptorrhynchus chinensis

2.3 溝眶象體內(nèi)Wolbachia 的wsp 基因序列分析

根據(jù)克隆測(cè)序結(jié)果得知，擴(kuò)增出的片段大小為593 bp，各種堿基含量:190T (32.0%)、90C(15.2%)、180A (30.4%)、133G (22.4)。獲得序列A+T 的含量為62.4%，A +T 含量明顯高于G+C 含量(37.6%)，與其它昆蟲相似。將獲得基因在NCBI 上進(jìn)行比對(duì)，與其他Wolbachia 的wsp基因同源性很高，確定為wsp 基因。該基因序列已提交到GenBank (登錄號(hào)為KP713759)。

2.4 溝眶象體內(nèi)Wolbachia 的wsp 基因的同源性分析

Wsp 同源性分析主要參照A.Jeyaprakash 在2000年提出的A、B 群分類方法，其中A 群分為10 個(gè)亞群，B 群分為11 亞群。從NCBI 中下載van Meer 等(1999)和Jeyaprakash 等(2000)分類中所用的38 條Wolbachia 的wsp 基因序列片段(表2)，及本文獲得溝眶象體內(nèi)的wsp 基因片段，使用MEGA 6.0 建立了NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，其中各分支的置信度用1000 次自導(dǎo)復(fù)制來(lái)評(píng)價(jià)。根據(jù)wsp 基因同源性，通過(guò)NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹分析，得出溝眶象體內(nèi)的Wolbachia 屬于A 群Dro 亞群(圖1)。溝眶象體內(nèi)的Wolbachia 與同屬Dro 亞群的Trichopria drosophilae 體內(nèi)的Wolbachia 菌株在61、64、68、81、363 處有堿基A 和堿基C 的置換，在117、132、150、159 處有堿基T 和堿基C 的置換，在67、84、85、168 有堿基A 和堿基G 的置換，在70 處有堿基A 和堿基T 的置換，在153 有堿基A和堿基G 的置換，在346 處有堿基C 和堿基G 的置換。

表2 用于構(gòu)建Wolbachia 系發(fā)育統(tǒng)樹的wsp 基因序列信息Table 2 The information of wsp gene for contracting the phylogenetic tree of Wolbachia strains

(續(xù)上表)

圖1 溝眶象感染的Wolbachia 的分類地位Fig.1 The classification status of Wolbachia infection Eucryptorrhynchus chinensis

3 結(jié)論與討論

本文對(duì)溝眶象的5 個(gè)地理種群進(jìn)行了隨機(jī)抽樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)地理種群的感染率均為100%。相關(guān)的報(bào)道中，也曾出現(xiàn)昆蟲的一些地理種群Wolbachia 感染達(dá)到100%的情況，但很少出現(xiàn)多個(gè)地理種群感染率均100%的情況，一般各個(gè)地理種群間都存在一定的差別(馮宏祖等，2014)。本文檢測(cè)的所有個(gè)體均受到Wolbachia 感染，推測(cè)Wolbachia 對(duì)溝眶象的感染率100%。但本文所采樣本及地理種群數(shù)較少，要證實(shí)推測(cè)需要增加地理種群數(shù)和樣本量。

Wolbachia 存在水平傳播的現(xiàn)象，其中一種是Wolbachia 在昆蟲與其他節(jié)肢動(dòng)物間的水平傳播。溝眶象的Wolbachia 感染率高達(dá)100%，有可能是寄生在臭椿樹的其他節(jié)肢動(dòng)物水平傳播所致，而且對(duì)臭椿樹上的另一種害蟲臭椿溝眶象也進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)到其體內(nèi)有相同的 wsp 基因的Wolbachia 菌株。Wolbachia 是否在二者之間發(fā)生了水平傳播，需要進(jìn)一步證明。

本文獲得的溝眶象感染的Wolbachia 的wsp 基因片段長(zhǎng)度為593 bp。與先前的報(bào)道中同樣使用wsp 通用引物(81F、691R)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后獲得片段長(zhǎng)度存在差異。蝶蛹金小蜂 Pteromalus puparum 感染的Wolbachia 通過(guò)通用引物PCR 擴(kuò)增后wsp 基因大小為540 bp (王歡等，2006)，蘋果蠹Cydia pomonella 蛾感染的Wolbachia 在PCR 擴(kuò)增后獲得wsp 基因片段大小為617 bp (馮宏祖等，2014)。而本文獲得wsp 基因片段為593 bp，長(zhǎng)度居中。溝眶象感染的Wolbachia 的wsp 基因片段與同屬 Dro 亞群的 Trichopria drosophilae 體內(nèi)的Wolbachia 菌株長(zhǎng)度相同，與其它亞群的wsp 基因長(zhǎng)度存在較大差異。

調(diào)控寄主的生殖是Wolbachia 的一個(gè)重要作用，主要包括誘導(dǎo)雌性化、胞質(zhì)不親和(CI)、誘導(dǎo)孤雌生殖、殺雄作用等。由于溝眶象幼蟲主要在臭椿根部取食，一般藥物防治很難達(dá)到效果。溝眶象體內(nèi)Wolbachia 的感染率100%，目前其體內(nèi)只檢測(cè)到1種Wolbachia。這種Wolbachia 屬于A 群Dro 亞群。同為Dro 亞群Trichopria drosophilae感染的Wolbachia 對(duì)寄主具有誘導(dǎo)CI 的能力(van Meer，1999)，據(jù)此推測(cè)溝眶象體內(nèi)的Wolbachia也可能誘導(dǎo)CI 的作用。如果能利用其誘導(dǎo)溝眶象CI，可以作為一種有效的生物防治手段。

本文通過(guò)wsp 基因只檢測(cè)到1種Wolbachia，如果采用基于多個(gè)基因位點(diǎn)的MLST 分類系統(tǒng)(MultilocusSequence Typing System)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的Wolbachia 菌株，但MLST 的亞型分類尚不完善(李菁等，2010)。隨著技術(shù)的發(fā)展，使用MLST 分類系統(tǒng)在溝眶象體內(nèi)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的Wolbachia 菌株。

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