神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)U251細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡

王雪晶，丁雪冰，滕軍放，馬明明，王志紅

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州450052;2.河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州450003;3.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州450014)

神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialotetrahexosy-1 ganglioside， GM1)是細(xì)胞膜的主要成分［1］。以往研究［2］發(fā)現(xiàn)外源性GM1 與脂蛋白結(jié)合，可通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與神經(jīng)修復(fù)及重構(gòu)的病理生理過程。膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，至今為止沒有有效的治療手段。本課題組之前研究已證實GM1 通過上調(diào)巨自噬水平誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬性死亡，本研究進(jìn)一步探討GM1 通過調(diào)控惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導(dǎo)其凋亡的具體機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 ～2 d 換液1 次。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%后，以消化液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%EDTA)消化，1∶4 比例傳代。

1.2 MTT 法檢測細(xì)胞存活率 U251 細(xì)胞接種于96孔板(密度為3 × 103/孔)，次日對照組給予常規(guī)DMEM 培養(yǎng)基，實驗組分為3 個濃度組，分別加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，每組設(shè)4 個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，每孔加10 μL MTT 和90 μL 無血清DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，加入150 μL DMSO 振蕩溶解，酶標(biāo)儀于570 nm 波長處測量吸光度(A)值，細(xì)胞存活率(%)=實驗組A 值/對照組A 值×100%。

1. 3 LDH 釋放檢測 實驗組加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，按照LDH 試劑盒說明操作并計算LDH 釋放率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 實驗組加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，48 h 后收集細(xì)胞，預(yù)冷1 ×PBS洗滌后棄去上清，重懸細(xì)胞于Annexin 結(jié)合緩沖液，每份標(biāo)本容量為120 μL，加入8 μL Alexa Fluor 488 AnnexinⅤ和2 μL 100 μg·mL－1PI 工作液，室溫下孵育15 min，加入400 μL Annexin 結(jié)合緩沖液，在冰上輕輕混勻，立即用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.5 Western blot 法檢測蛋白表達(dá) 0、100、250 μg·mL－1的GM1 孵育48 h 后收集細(xì)胞，提取總蛋白并檢測。經(jīng)SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜后封閉，加入抗CHOP(1 ∶500)、抗caspase-12(1 ∶500)抗體，4 ℃過夜。加入HRP 標(biāo)記的二抗，孵育2 h，ECL 液顯色，膠片曝光，GAPDH 設(shè)為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0 進(jìn)行分析，計量資料用±s 表示，組間比較采用t 檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GM1 對U251 細(xì)胞存活率的影響 MTT 法檢測結(jié)果顯示:0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 細(xì)胞存活率分別為(96. 0 ±4. 2)%、(74. 1 ±13.2)%、(59.2 ±10.3)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05)，且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 GM1 對U251 細(xì)胞存活率的影響

2.2 GM1 對U251 細(xì)胞LDH 釋放率的影響 U251細(xì)胞經(jīng)0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，收集培養(yǎng)上清液，按照LDH 試劑盒說明操作并計算LDH釋放率。LDH 釋放率(%)= 上清LDH/總LDH ×100%，以對照組為100%，實驗組與對照組比較。0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 細(xì)胞LDH釋放 率 為(100. 0 ± 6. 3)%、(140. 0 ± 15. 5)%、(172.0 ±11.3)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 GM1 對U251 細(xì)胞LDH 釋放率的影響

2.3 GM1 對U251 細(xì)胞凋亡率的影響 0、100、250μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 細(xì)胞凋亡率為(3.1±0.2)%、(16.0 ±1.9)%、(37.1 ±12.1)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05)，且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 GM1 對U251 細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 GM1 對U251 細(xì)胞CHOP、caspase-12 表達(dá)水平變化的影響 與對照組比較，0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，CHOP 表達(dá)水平明顯上調(diào)，且呈現(xiàn)劑量依賴性(P ＜0.05);caspase-12 活性片段表達(dá)水平明顯上調(diào)，且呈現(xiàn)劑量依賴性(P ＜0.05)。見圖4。

圖4 GM1 對CHOP 及caspase-12 表達(dá)水平的影響

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯后修飾、折疊和組裝的場所，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相關(guān)修飾以及蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運等過程受阻，或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量蓄積則會損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，稱為ERS［3］。ERS 主要激活3 條信號通路:未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解功能和調(diào)節(jié)多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的翻譯過程的調(diào)控［3］。ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一種新的凋亡途徑，與死亡受體途徑和線粒體途徑不同，ERS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程更為復(fù)雜，主要通過3 種途徑:CHOP 途徑、ASK1-JND 途徑和caspase-12途徑［4］。ERS 是一種高度保守的細(xì)胞反應(yīng)機制，適度的ERS 對細(xì)胞有保護作用，而過度的ERS 啟動了ERS相關(guān)凋亡過程。研究［5］表明，ERS 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而ERS 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞自然死亡的一種重要形式，這為腫瘤治療研究提供新方向。

根據(jù)糖基數(shù)目不同，GM 分為GM1(含4 個糖基)、GM2(含3 個糖基)和GM3(含2 個糖基)［6－7］。隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)GM1 不緊參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、神經(jīng)生長與修復(fù)等生理過程，也參與抑制了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等病理過程，但具體機制仍不明［8］。膠質(zhì)瘤是原發(fā)于神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后差，平均生存周期不超過1 a［9］。手術(shù)是膠質(zhì)瘤的主要治療方式，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，各種單一的治療方案難以取得令人滿意的效果。因此，探索新的治療手段具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著GM1 濃度的增加U251 細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞損傷增加，細(xì)胞凋亡率增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。進(jìn)一步研究證實，隨著GM1 濃度的增加可誘導(dǎo)U251 細(xì)胞ERS 相關(guān)通路CHOP/caspase-12 激活，從而誘發(fā)ERS 相關(guān)凋亡的啟動，導(dǎo)致U251 細(xì)胞的死亡。綜上所述，GM1 通過誘導(dǎo)ERS 相關(guān)凋亡抑制了U251 細(xì)胞的生長，促進(jìn)人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程，為GM1 治療惡性腦膠質(zhì)瘤提供了新的理論依據(jù)。

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