齊墩果酸對CCl4誘導小鼠急性肝損傷保護作用的實驗研究

郗艷麗，吳啟坤，馮 威，張洋婷，宋春梅，馬洪波，王舒然

(吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林132013)

·論 著·

齊墩果酸對CCl4誘導小鼠急性肝損傷保護作用的實驗研究

郗艷麗，吳啟坤，馮 威，張洋婷，宋春梅，馬洪波，王舒然*

(吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林132013)

目的 研究齊墩果酸對CCl4誘導小鼠急性肝損傷保護作用。方法 30只雄性昆明小鼠隨機分成正常對照組、模型組和齊墩果酸組。齊墩果酸組以300 mg/kg齊墩果酸豆油溶液灌胃，模型組和正常對照組以相同劑量的豆油灌胃，共2 d。末次灌胃給藥后，模型組和齊墩果酸組按3 mL/kg劑量皮下注射CCl4原液，正常對照組皮下注射同等體積的生理鹽水。24 h后處死小鼠，摘取肝臟，比較各組小鼠肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量，并觀察肝臟組織的臟器系數(shù)及病理學改變。結(jié)果 齊墩果酸能顯著升高CCl4引起的SOD降低(P＜0.05)，降低CCl4導致的MDA的升高(P＜0.05)。與模型組相比，齊墩果酸組肝臟的臟器系數(shù)有下降的趨勢，同時減輕了肝臟的病理損害。結(jié)論 齊墩果酸對CCl4所引起的急性肝損傷具有一定的保護作用。

齊墩果酸;急性肝損傷;保護作用

齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)又名土當歸酸，是一類廣泛存在于多種植物中的五環(huán)三萜類化合物，目前被證實其具有降糖、降脂、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及保肝護肝等多種藥理作用［1-2］。本實驗研究齊墩果酸對四氯化碳(CCl4)誘導的急性肝損傷的保護作用，并探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸購于西安文竹生物科技有限公司(HPLC≥98%)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。722型分光光度計:中國廈門分析儀器廠;離心機(TDZ5-WS):湖南湘儀離心機儀器有限公司;電子天平(BS224S):北京賽多利斯;電動玻璃勻漿機(DY89-Ⅱ):寧波新芝生物科技股份有限公司。尼康科研級正置熒光顯微成像系統(tǒng);Leica半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2245);Leica組織包埋機(EG1150H+C)。

1.2 動物分組及給藥方法

30只健康雄性昆明小鼠，普通級，體重(27±2) g，購于吉林大學動物室。全部動物隨機分成3組，每組10只，分別為正常對照組、模型組和齊墩果酸組。齊墩果酸組給予齊墩果酸豆油溶液(300 mg/kg)灌胃。正常對照組和模型組以等體積豆油灌胃，1次/ d，連續(xù)2 d，末次給藥后30 min，模型組和齊墩果酸組均皮下注射CCl4原液(3 mL/kg)，禁食，不禁水。正常對照組皮下注射同等劑量的生理鹽水。24 h后處死小鼠。取肝臟備檢。

1.3 肝臟臟器系數(shù)的測定

稱量每只小鼠活體重，處死后稱量肝臟濕重。肝臟臟器系數(shù) =肝臟濕重(g)/小鼠活體重(g)× 100%。

1.4 病理組織學檢測

切取肝臟右葉置于10%福爾馬林溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色并鏡檢。

1.5 超氧化物歧化酶檢測

切取肝臟左葉0.5 g，加入4.5 mL生理鹽水，置于電動玻璃勻漿機制備成10%的肝臟組織勻漿。1 500 rpm持續(xù) 1 min，研杵上下移動 15次。3 000 rpm離心10 min，取上清，鄰苯三酚法檢測肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)含量。

1.6 丙二醛檢測

切取肝臟左葉0.5 g，加入4.5 mL 150 mmol/L KCl溶液，置于電動玻璃勻漿機制備成10%的肝臟組織勻漿。1 500 rpm持續(xù)1 min，研杵上下移動15次。3 000 rpm離心10 min，取上清，硫代巴比妥酸法檢測肝組織勻漿中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸對小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響

由表1可知，模型組與正常對照組的肝臟臟器系數(shù)經(jīng)方差分析比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，模型組肝臟的臟器系數(shù)高于正常對照組，說明利用CCl4所制備的急性肝損傷模型造模成功。利用齊墩果酸提前干預的齊墩果酸組的肝臟臟器系數(shù)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與模型組比較差異也無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但是齊墩果酸組的肝臟臟器系數(shù)明顯地低于模型組，而與正常對照組比較，略有增高。這一結(jié)果表明，齊墩果酸對CCl4誘導的急性肝損傷有一定的保護作用。

表1 齊墩果酸對小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響

2.2 肝臟的病理改變

光鏡下可見正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見肝細胞腫脹、病變以及壞死。模型組肝臟細胞可見明顯的腫脹，體積增大，伴有炎性細胞浸潤。齊墩果酸組部分肝臟細胞可見腫脹，與模型組比較，細胞體積雖有增大，但不明顯，正常肝細胞數(shù)目較多。

2.3 齊墩果酸對小鼠肝臟SOD含量的影響

模型組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，模型組SOD活性與對照組相比明顯降低。齊墩果酸組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。齊墩果酸組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，齊墩果酸組SOD活性與模型組相比明顯升高。SOD活性檢測結(jié)果表明，齊墩果酸可以改善由CCl4所引起的SOD活性降低，提高動物機體的抗氧化能力(圖1)。

2.4 齊墩果酸對小鼠肝臟MDA含量的影響

模型組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，模型組肝臟MDA含量與對照組相比明顯升高。齊墩果酸組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。齊墩果酸組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，齊墩果酸組肝臟MDA含量與模型組相比明顯降低。MDA含量檢測結(jié)果表明，齊墩果酸可以改善由CCl4所引起的MDA水平降低，抑制由CCl4導致的氧化損傷(圖2)。

圖1 齊墩果酸對小鼠肝臟SOD含量的影響

圖2 齊墩果酸對小鼠肝臟MDA含量的影響

3 討論

肝損傷模型的造模方法有很多種，其中由CCl4誘導的急性肝損傷模型是最常見的肝損傷模型之一。造模原理是由于CCl4易溶解脂肪，是一種非常典型的肝臟毒物。CCl4進入體內(nèi)后，會引起細胞的脂質(zhì)過氧化損傷，其中由磷脂雙分子層組成的細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損嚴重，引起細胞膜的通透性增高，最終導致肝細胞出現(xiàn)腫脹，甚至是壞死，出現(xiàn)急性肝損傷的癥狀［5-6］。本實驗所制備的急性肝損傷模型組，其肝臟的臟器系數(shù)明顯高于正常對照組，且組織切片檢測結(jié)果表明肝臟細胞出現(xiàn)了腫脹，這表明由于CCl4的作用導致肝臟出現(xiàn)了炎性浸潤的癥狀，細胞膜的通透性增加，進而導致了肝臟的臟器系數(shù)增高，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致［7］。

SOD是生物體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)，能夠?qū)棺杂苫鶎毎斐傻难趸瘬p傷，并能夠使受損的細胞修復，可作為急性肝損傷的檢測指標之一。當機體受到自由基損傷以后，SOD的生物活性會受到影響，導致活性降低。CCl4作用于機體后會導致機體內(nèi)自由基含量升高，SOD活性降低。實驗小鼠提前給予齊墩果酸作用后，當接觸CCl4后對機體產(chǎn)生了一定的保護作用，SOD的活性受CCl4的影響不大。

MDA是生物體脂質(zhì)發(fā)生氧化反應的終產(chǎn)物，其具有細胞毒性作用。因此，MDA的大量產(chǎn)生表明體內(nèi)受大量自由基作用。CCl4作用實驗小鼠以后，模型組MDA的含量明顯高于正常對照組，表明CCl4已經(jīng)造成了急性肝損傷，模型制備成功。齊墩果酸組MDA的含量與對照組相比明顯下降，表明齊墩果酸對CCl4誘導的急性肝損傷有保護作用。齊墩果酸可能是通過清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應，起到保護肝臟的作用。提前服用齊墩果酸，可以避免肝臟的急性損傷，尤其是氧化應激引起的急性損傷。齊墩果酸在保肝、護肝方面具有很大的開發(fā)前景。

［1］ 張小麗，韋晟.齊墩果酸對大鼠星形膠質(zhì)細胞糖原代謝的影響［J］.中國臨床藥理學雜志，2013，29(4):293-295.

［2］ 董靜，李明珠，畢克濱，等.原位末端標記法檢測齊墩果酸誘導細胞凋亡的實驗研究［J］.中醫(yī)藥信息，2013，30 (3):134-135.

［3］ 熊筱娟，陳武，肖小華，等.烏索酸與齊墩果酸對小鼠實驗性肝損傷保護作用的比較［J］.江西師范大學學報:自然科學版，2004，28(6):540-543.

［4］ 羅奕，劉文.齊墩果酸對四氯化碳所致大鼠肝纖維損傷的保護作用［J］.中國藥師，2014，17(3):378-381.

［5］ 林冬靜，金政.決明子提取物對急性肝損傷保護作用的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(2):214-215.

［6］ 陳紅霞，吳咖，黃仁彬，等.相思藤總黃酮對小鼠急性化學性肝損傷的保護作用及機制［J］.廣西醫(yī)學，2012，34 (2):138-141.

［7］ 路朋，曾陽，郭鳳霞，等.絲毛飛廉總黃酮對CCl4肝損傷的保護作用［J］.青海師范大學學報:自然科學版，2010 (2):42-43.

The protective effects of oleanolic acid against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in m ice

XIYanli，WU Qikun，F(xiàn)ENGWei，ZHANG Yangting，SONG Chunmei，MA Hongbo，WANG Shuran*
(School of Public Health，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

Objective To study the protective effects of oleanolic acid against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in micee.Methods Thirtymalemice were randomly divided into normal group，model group and oleanolic acid group.Oleanolic acid group was pretreated with oleanolic acid and soybean oilmixture solution by intragastric administration at the dosage of 300 mg/kg for 2 days;model and normal groupswere pretreated with the same volume of soybean oil.On the last day of intragastric administration，model and oleanolic acid groupswere subcutaneous injected with 3 mL/kg carbon tetrachloride，and normal group was subcutaneous injected with the same volume of physiological saline.Twenty-four hours after subcutaneous injection，themice were sacrificed and liverswere removed.The contents of SOD and MDA from liver homogenate serum were determined，and the organ coefficient and pathological changes of liver were alsomeasured.Results Oleanolic acid significantly increased the low level of SOD and decreased the high level of MDA-induced by carbon tetrachloride.Compared with themodel group，the organ coefficient and pathological damage of liver in oleanolic acid group was slightly decreased.Conclusion Oleanolic acid has protective effects against acute liver injuryinduced by carbon tetrachloride.

oleanolic acid;acute liver injury;protective effects

R285.5

A

1673-2995(2015)01-0001-03

2014-08-04)

郗艷麗(1981－)，女(漢族)，講師，博士.

王舒然(1968－)，男(漢族)，教授，博士.