七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的影響與Caveolin-3 表達(dá)的關(guān)系

郝麗兵，焦麗媛，趙建力

(山西醫(yī)科大學(xué)， 山西 太原　030001)

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七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的影響與Caveolin-3 表達(dá)的關(guān)系

郝麗兵，焦麗媛，趙建力*

(山西醫(yī)科大學(xué)， 山西 太原030001)

[摘要]目的：評(píng)價(jià)不同濃度及不同給藥模式七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的影響及Caveolin-3在其中的作用。方法：采集健康雄性Wistar大鼠，使用改良Langedorff灌注裝置制備離體心臟灌注模型，將其均分為6組(n=10)：對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)、持續(xù)1.5%七氟醚預(yù)處理組(APC-1)、持續(xù)2.5%七氟醚預(yù)處理組(APC-2)、間斷1.5%七氟醚預(yù)處理組(APCI-1)和間斷2.5%七氟醚預(yù)處理組(APCI-2)。采用氯化三苯基四氮唑染色法評(píng)價(jià)離體心臟缺血再灌注損傷梗死面積，取左心室心肌細(xì)胞測(cè)定Caveolin-3的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組相比，缺血再灌注組心肌梗死面積增大，Caveolin-3表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與缺血再灌注組相比，七氟醚預(yù)處理組心肌梗死面積減小，Caveolin-3表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預(yù)處理組間相比，持續(xù)給藥模式較間斷給藥模式組心肌缺血再灌注梗死面積減小，Caveolin-3表達(dá)上調(diào)最明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間心肌梗死面積、Caveolin-3表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：七氟醚預(yù)處理能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，縮小梗死面積；持續(xù)七氟醚預(yù)處理具有明顯的心肌保護(hù)作用其作用機(jī)制可能與上調(diào)Caveolin-3的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]七氟醚；心肌缺血再灌注損傷；缺血預(yù)處理； Caveolin-3

Effects of Sevoflurane Preconditioning on Myocardial Cells during Myocardial Ischemia-reperfusion in Rats and the Relationship of the Expression of Caveolin-3

HAO Libing, JIAO Liyuan, ZHAO Jianli

(ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,Shanxi,China)

[ABSTRACT]Objective: To evaluate the effects of sevoflurane preconditioning with different concentration and different administration model on myocardial cells during myocardial ischemia-reperfusion in rats and the role of Caveolin-3. Methods：The healthy male SD rats were completely randomly assigned to 6 different groups (n=10 each) using a random number table, controlling group(group C)，I/R group, Lasting 1.5% sevoflurane preconditioning group(APC-1), Lasting 2.5% sevoflurane preconditioning group(APC-2), Intermittent 1.5% sevoflurane preconditioning group(APCI-1) and intermittent 2.5% sevoflurane preconditioning group(APCI-2). TTC(Triphenyl tetrazolium chloride) staining evaluated the infarct size of myocardial infarction, and immunohistochemistry evaluated the expression of Caveolin-3 on left ventricle. Results: Compared with the controlling group (group C), myocardial infarction area increased and Caveolin-3 expression decreased in group I/R. There was statistically significant difference(P<0.05). Compared with the group I/R, myocardial infarction area decreased, and Caveolin-3 expression raised in Sevoflurane preconditioning group. There was statistically significant difference(P<0.05). In different sevoflurane preconditioning group, myocardial infarction size decreased, and Caveolin-3 expression raised. There was statistically significant difference in last sevoflurane preconditioning group compared with intermittent sevoflurane preconditioning group(P<0.05). But myocardial infarction area and Caveolin-3 expression had no statistical significance in different concentrations of sevoflurane group(P>0.05).Conclusion: Sevoflurane preconditioning can attenuate myocardial ischemia reperfusion injury in rats, possibly associated with upregulated Caveolin-3 expression and narrowing the area of myocardial infarction. The effection of myocardial protection is the most obvious in continuing sevoflurane preconditioning group.

[KEYWORD] sevoflurane；myocardial reperfusion injury；ischemic preconditioning；Caveolin-3

隨著冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、急性心肌梗死溶栓術(shù)及體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)等臨床治療手段的廣泛應(yīng)用，術(shù)中均可能發(fā)生心肌缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注損傷是一種常見病理生理過(guò)程，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)性缺血和再灌注可誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆性死亡。已有研究證實(shí)，缺血預(yù)處理是最有效的心肌保護(hù)方法之一[1]，而七氟醚可發(fā)揮與缺血預(yù)處理相似的心肌保護(hù)效應(yīng)。這為臨床心臟病人行心臟或非心臟手術(shù)時(shí)麻醉方案的選擇提供了理論依據(jù)。Caveolin-3是一種重要的膜結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，可特異性地表達(dá)于心肌細(xì)胞，在維持細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)以及信息傳導(dǎo)中起著重要作用，心肌研究提示它與心肌發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)和能量代謝密切相關(guān)[2-4]。本研究擬探討不同濃度及不同給藥模式七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞的影響及Caveolin-3在其中的作用。

1材料和方法

1.1主要試劑與儀器

七氟醚(上海恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，K-H液(mmol/L：NaCl 118．5、NaHC0325.0、KCl 4．75、MgS041.2、KH2P041.2、CaCl22.5、葡萄糖1.11)，Caveolin-3單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，七氟醚揮發(fā)罐(Dmger公司，德國(guó))，麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀(Dmger Vamos公司，德國(guó))，TTC染料(Amrecro公司)。

1.2動(dòng)物選擇與模型制備

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，6～8周齡，體重280～360 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腹腔注射肝素1 000 IU/kg抗凝，迅速開胸取出心臟，放入4℃ K-H液中，修剪心臟周圍組織，輕輕擠壓心臟，洗清殘留血液，懸掛于Langendofff離體灌注裝置上固定。用37℃、95%O2和5%CO2混合氣體，持續(xù)充氣平衡30 min的K-H液灌注30 min，pH值7.35～7.45，灌注壓90 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和處理

離體心臟60個(gè)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，均分為6組(n=10)：對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)、持續(xù)1.5%七氟醚預(yù)處理組(APC-1)、持續(xù)2.5%七氟醚預(yù)處理組(APC-2)、間斷1.5%七氟醚預(yù)處理組(APCI-1)和間斷2.5%七氟醚預(yù)處理組(APCI-2)。C組繼續(xù)灌注K-H液90 min；IR行全心缺血30 min，再灌注60 min；持續(xù)1.5%七氟醚預(yù)處理組(APC-1)通過(guò)七氟醚揮發(fā)罐將1.5%七氟醚持續(xù)吹入K-H液中，用預(yù)充1.5%七氟醚的K-H液灌注15 min，之后行全心缺血30 min，再灌注60 min；持續(xù)2.5%七氟醚預(yù)處理組(APC-2)處理方法同APC-1；間斷1.5%七氟醚預(yù)處理組(APCI-1)通過(guò)七氟醚揮發(fā)罐將1.5%七氟醚持續(xù)吹入K-H液中，用預(yù)充1.5%七氟醚的K-H液灌注5 min，然后用K-H液灌注5 min，再次恢復(fù)含七氟醚的K-H灌注5 min，共計(jì)15 min，之后行全心缺血30 min，再灌注60 min；間斷2.5%七氟醚預(yù)處理組(APCI-2)處理方法同APCI-1。采用麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)七氟醚濃度。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1離體心肌缺血再灌注梗死面積灌流結(jié)束后，每組隨機(jī)取5只，取下心臟，取刀片垂直心臟長(zhǎng)軸將其橫切為5片，每片約為2 mm。展平后置于PBS(0.1 mol/L)溶解的1%TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，取出后置于10%中性甲醛(0.1 mol/L PBS配制)中。于染色后l周對(duì)4個(gè)橫切片的正反兩面進(jìn)行圖像采集[5]，照片采用Photoshop 3S Extended軟件計(jì)算梗死面積。梗死面積百分比(%)=梗死面積/橫切片總面積×100%。

1.4.2免疫組化檢測(cè)Caveolin-3表達(dá)取左心室心肌組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，脫蠟，山羊血清封閉，滴加Caveolin-3單克隆抗體(稀釋度1∶100)，4℃孵育過(guò)夜；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的大鼠IgG抗體(稀釋度1∶10 000)，37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下觀察呈棕黃色染色為陽(yáng)性，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度值，反映Caveolin-3的表達(dá)[6]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組大鼠TTC染色心肌缺血再灌注梗死面積比較

與C組相比，IR組心肌梗死面積增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與IR組相比，APC-1、APC-2、APCI-1、APCI-2組心肌梗死面積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預(yù)處理組間相比，可見持續(xù)給藥模式較間斷給藥模式組心肌缺血再灌注梗死面積減小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間心肌梗死面積比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠TTC染色心肌缺血再灌注梗死面積比較(±s)%Table 1　Comparison of the Area of Myocardial Infarction in Rats with TTC Staining in Each Group(±s)　%

2.2各組大鼠缺血再灌注心肌免疫組化Caveolin-3表達(dá)比較

與C組比較，IR組Caveolin-3表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與IR組相比，APC-1、APC-2、APCI-1、APCI-2組Caveolin-3表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預(yù)處理組間相比，持續(xù)給藥模式較間斷給藥模式組Caveolin-3表達(dá)增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間Caveolin-3表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠缺血再灌注心肌Caveolin-3表達(dá)%Table 2　The Expression of Caveolin-3 on Myocardial Cells during Myocardial Ischemia-reperfusion in Rats(±s)　　%

3討論

在心肌缺血再灌注過(guò)程中，細(xì)胞凋亡是引起損傷的重要病理機(jī)制之一 。如何有效抑制心肌缺血所致細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，從而促進(jìn)缺血再灌注心肌功能恢復(fù)、減輕心肌致死性損傷，是研究探索的熱點(diǎn)。心肌細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，通過(guò)表1可見，與對(duì)照組相比，缺血再灌注組心肌梗死面積增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與缺血再灌注組相比，七氟醚預(yù)處理組心肌梗死面積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預(yù)處理組間相比，可見持續(xù)給藥模式較間斷給藥模式組心肌缺血再灌注梗死面積減小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間心肌梗死面積比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

窯蛋白是細(xì)胞膜上的特異性囊狀小凹結(jié)構(gòu)，由脂類(如膽固醇、鞘糖脂和鞘磷脂)和蛋白質(zhì)組成。窯蛋白能與多種關(guān)鍵信號(hào)分子，如G蛋白、Ha-Ras、Src酪氨酸激酶家族成員、EGF受體、胰島素受體、PKC、eNOS，對(duì)其活性起負(fù)性調(diào)控作用，從而參與細(xì)胞分化、增殖、腫瘤發(fā)生、炎癥和細(xì)胞衰老等病理生理過(guò)程。窯蛋白可分為3種亞型，其中Caveolin-3于1996年首次鑒定，并發(fā)現(xiàn)高水平Caveolin-3僅存在于骨骼肌和心肌的微囊和T管，暗示微囊蛋白在肌細(xì)胞中有特殊作用,被認(rèn)為是Caveolin參與心臟的缺血再灌注損傷保護(hù)作用的重要成分,Caveolin-3的作用通路已有初步研究，但具體機(jī)制尚未完全闡明。Caveolin-3可以通過(guò)與Ca2+-ATPase、G蛋白α亞單位、eNOS、Ras及上皮生長(zhǎng)因子受體等的共同特異序列結(jié)合后，能抑制它們的活性，因此成為一個(gè)心臟的缺血再灌注保護(hù)作用研究的新治療靶點(diǎn)。通過(guò)表2可見，與對(duì)照組比較，缺血再灌注組Caveolin-3表達(dá)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與缺血再灌注組相比，七氟醚預(yù)處理組Caveolin-3表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度及給藥模式的七氟醚預(yù)處理組間相比，持續(xù)給藥模式較間斷給藥模式組Caveolin-3表達(dá)增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同濃度七氟醚組間Caveolin-3表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過(guò)表1和表2可以看出，Caveolin-3表達(dá)增高時(shí)，心肌細(xì)胞缺血再灌注時(shí)心肌梗死面積減小。提示七氟醚預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制可能與上調(diào)Caveolin-3的表達(dá)有關(guān)。而七氟醚如何通過(guò)上調(diào)Caveolin-3表達(dá)而減輕心肌細(xì)胞梗死有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]朱俊超,蘭培麗,李陽(yáng).七氟醚預(yù)先給藥對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)胱硫醚-合酶和血紅素氧合酶-1表達(dá)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2012,32(5)：600-603.

[2]Tang Z，Scherer PE，Okamoto T，etal．Molecular Cloning of Caveolin-3，a Novel Member of the Caveolin Gene Family Expressed Predominantly In Muscle[J]．J Biol Chem，1996，271(4)：2255-2261．

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[6]張彥清，趙建力，劉保江.七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注時(shí)窯蛋白-3表達(dá)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2014,34(1)：79-81.

本文編輯：王知平

[通訊作者]趙建力，男，副教授， E-mail：haolibing8@163.com

[作者簡(jiǎn)介]郝麗兵，男，主治醫(yī)師，麻醉學(xué)碩士研究生在讀

[中圖分類號(hào)]R654.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-0126(2015)02-0003-04