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    頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定血中一氧化碳

    2015-12-08 09:23:58婷王瑞花于忠山
    關(guān)鍵詞:空瓶檢材頂空

    張 婷王瑞花于忠山

    (1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035;2 公安部物證鑒定中心 北京 100038)

    頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定血中一氧化碳

    張婷1王瑞花2于忠山2

    (1中國(guó)刑警學(xué)院遼寧沈陽110035;2公安部物證鑒定中心北京100038)

    詳細(xì)考察了頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-GC-MS)分析方法測(cè)定血中一氧化碳的多種影響因素,包括頂空體積、加熱溫度、加熱時(shí)間、加酸方式、制備飽和血樣的方法等內(nèi)容。同時(shí)對(duì)相同案件檢材的HS-GC-MS分析方法與常規(guī)分光光度法進(jìn)行比較,得出HS-GC-MS檢測(cè)一氧化碳的注意事項(xiàng),以及其對(duì)腐敗檢材測(cè)定更具優(yōu)勢(shì)的結(jié)論。

    一氧化碳頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法醫(yī)毒物分析

    一氧化碳(CO)與血紅蛋白高度的親和力使血液失去攜氧功能,極易造成組織缺氧而引起人的急性中毒或死亡,這類案件時(shí)有發(fā)生。因此,快速、準(zhǔn)確檢測(cè)血中碳氧血紅蛋白含量是判定一氧化碳中毒程度的關(guān)鍵。血中一氧化碳檢測(cè)常用的方法有分光光度法和紫外導(dǎo)數(shù)分光光度法,方法具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),但分光光度法在計(jì)算過程中需應(yīng)用不同的經(jīng)驗(yàn)公式來計(jì)算含量,因此,分光光度法對(duì)于血液的新鮮程度依賴程度較高。HS-GC-MS是色譜分析法,已報(bào)道的文獻(xiàn)中證明了該法具有靈敏度高、線性范圍寬、適合腐敗血液、多種生物臟器組織檢材等優(yōu)點(diǎn)。[1-4]但HS-GC-MS法若想在實(shí)踐工作中作為標(biāo)準(zhǔn)方法來使用,還需要對(duì)影響HS-GC-MS定量分析的影響因素進(jìn)一步考察,還需要對(duì)同樣檢材的常規(guī)分光光度法測(cè)定與HS-GC-MS測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。因此,本文就上述內(nèi)容進(jìn)行研究,以期對(duì)血中一氧化碳的HS-GC-MS分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化操作提供借鑒。

    1 材料和方法

    1.1溶液配制

    乳酸溶液:取乳酸12.5mL于帶蓋錐形瓶中,加去離子水37.5mL,混勻,即得25%乳酸溶液;血液稀釋劑:稱取0.25g連二亞硫酸鈉和0.093g三羥甲基氨基甲烷(THAM),加入100mL去離子水中,混勻。

    1.2儀器條件

    1.3實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1飽和血樣制備

    取血樣,用去離子水1∶1稀釋后,取適量體積于頂空瓶中,加1-辛醇2~3滴,通入一氧化碳?xì)怏w30min,每隔2~3min,晃動(dòng)頂空瓶使一氧化碳制備均勻。30min后取頂空瓶在氮?dú)饬飨峦?~3min,以便去除血液中未結(jié)合血紅蛋白的CO氣體,密閉保存。

    1.3.2檢材樣品制備

    取檢血0.4mL(n=2或3),加入12mL頂空瓶中,鋁蓋密封,再用1mL注射器抽取25%乳酸液0.5mL注入頂空瓶中,將密封的頂空瓶放入80℃加熱塊加熱10min后,準(zhǔn)確抽取0.3mL頂空氣體,迅速進(jìn)行GC/MS分析。

    1.3.3對(duì)照樣品制備

    取檢血0.4mL(n=2或3),加入12mL頂空瓶中,按照“1.3.1飽和血樣制備”方法,通入一氧化碳?xì)怏w至檢血飽和,用鋁蓋密封后,余下步驟按照1.3.2等操作過程,準(zhǔn)確抽取0.3mL頂空氣體,迅速進(jìn)行GC/MS分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1定量線性范圍

    取HbCO飽和血與空白血按比例混合,配制成0%(空白血)、25%、50%、75%、100%濃度的HbCO血各1mL,余下步驟按照1.3.2操作,頂空制樣GC/MS分析。以濃度為橫坐標(biāo)x,以吸收峰面積為縱坐標(biāo)y,得y=1.0×107x+512270(r=0.9924,n=3)。

    2.2實(shí)驗(yàn)條件考察

    2.2.1飽和血樣的制備

    通氣時(shí)間:取5份不同來源的空白血液分成5組,每1組空白血再分成4個(gè)水平,每個(gè)水平通CO氣體時(shí)間不同,分別為5min、10min、15min、30min和40min,通氣體操作同1.3.1。將通好CO的血檢材,平行操作分裝到12mL頂空瓶中,余下操作同1.3.2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著通氣時(shí)間延長(zhǎng),CO峰面積測(cè)值呈上升趨勢(shì),5~15min通氣時(shí)間明顯不足,30~40min通氣時(shí)間測(cè)量結(jié)果變化不大,證明達(dá)到飽和血樣制備的要求。這與文獻(xiàn)[2]中報(bào)道的通CO氣體10~20min即可達(dá)到飽和的結(jié)果不相符,主要原因分析可能是本文采用石英毛細(xì)管通CO,CO氣泡控制較小,造成反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。

    飽和程度的判定:一氧化碳飽和血樣的制備是頂空-氣質(zhì)定量測(cè)定的關(guān)鍵性步驟,通常將檢材血通CO一段時(shí)間,以其作為參比,測(cè)定值當(dāng)作飽和值,如果通氣過程達(dá)不到飽和程度,會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏高,準(zhǔn)確性遭到質(zhì)疑,用檢材飽和血來制作參比,可以消除血色素和腐敗的影響,但是以HS-GC-MS法測(cè)定來判定碳氧血紅蛋白飽和程度,操作方法耗時(shí),對(duì)血液的需求量也較大,因此本文借用了紫外分光光度法,快速評(píng)價(jià)飽和血的測(cè)定方法。

    這種方法將通CO的血液每隔5min取出1~2滴,用血液稀釋劑以1∶200的倍數(shù)稀釋,在500~600nm范圍內(nèi)掃描,測(cè)定538nm和555nm處的吸收光值,按照文獻(xiàn)[5]中的經(jīng)驗(yàn)公式,新鮮血液的(A538/A555)100=1.23左右即認(rèn)定飽和,或者是在500~600nm范圍內(nèi)掃描的峰型圖形不發(fā)生改變且(A538/A555)100比值保持不變,也可以認(rèn)定血液達(dá)到飽和程度。

    2.2.2頂空熱塊加熱時(shí)間

    加熱時(shí)間:頂空瓶采取熱塊加熱的方式,首先將熱塊溫度設(shè)定為80℃,接下來取4組頂空瓶,每組3瓶,依次在每個(gè)頂空瓶中加入0.4mLHbCO飽和血,密封頂空瓶,加熱前用注射器注入25%乳酸0.5mL混勻,置熱塊加熱時(shí)間分別為5min,10min,15min和30min,進(jìn)樣比較。結(jié)果表明在該溫度下加熱時(shí)間10min足夠,時(shí)間延長(zhǎng)色譜峰吸收峰面積略有下降,但不顯著。

    加熱溫度:本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)文獻(xiàn)[1、3]報(bào)道的方法中考察了熱塊溫度控制在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃(n=3)等情況下的實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明加熱溫度從50~110℃,對(duì)其靈敏度幾乎不影響,為便于操作,本文選定80℃。

    2.2.3加酸及加酸方式考察

    酸的種類:在GC/MS定性定量分析中,是檢測(cè)檢材全血中的總CO量,需要加入一定量的酸使結(jié)合態(tài)HbCO變成游離態(tài)CO。本文比較了相同濃度的乳酸和磷酸,分2組,每組3瓶,按照1.3.2的操作方法,比較制備的飽和一氧化碳血液的HS-GC-MS法測(cè)定CO峰面積,結(jié)果未見明顯差異。乳酸屬于有機(jī)酸,其作用相對(duì)溫和,在熱塊加熱過程中緩慢釋放CO,不建議用強(qiáng)酸反應(yīng),強(qiáng)酸會(huì)造成血液中蛋白質(zhì)變性、碳化等現(xiàn)象。

    加酸方式:取3組頂空瓶,每組3瓶,依次在每個(gè)頂空瓶中加入0.4mL一氧化碳飽和血,第一組直接密封頂空瓶,在熱塊加熱前用注射器加入25%乳酸0.5mL;第二組加入25%乳酸0.5mL后密封頂空瓶,之后熱塊加熱;第三組是加入0.5mL乳酸于小玻璃瓶中,將小玻璃瓶放入頂空瓶后密封,臨用前混合。結(jié)果表明將乳酸置于小瓶中臨用前混合的效果最好,CO損失小,但操作稍微繁瑣。加酸后再密封頂空瓶的操作,其過程中會(huì)有CO氣體損失,在與密封后加酸的操作相比,CO的損失量約為11%。

    酸的用量:頂空法分析中兩相間的體積變化對(duì)測(cè)定結(jié)果是有影響的,依據(jù)計(jì)算公式:

    式中,A是待測(cè)物的氣相色譜峰面積;CG是頂空中的待測(cè)物的濃度;C0是液體樣品中待測(cè)物的初始濃度,K是分配系數(shù);β是相量比。參數(shù)K的效率由提取溫度和β決定,是受兩相間(物質(zhì))相對(duì)的體積量決定。對(duì)于一氧化碳這樣的一個(gè)分配系數(shù)比較大的分析物,相比β對(duì)峰面積影響不大。本文考察了乳酸加入體積分別為0.5mL和1.0mL,以及檢材體積為0.4mL和0.8mL,相對(duì)于12mL頂空瓶的總體積來說,β變化不大,體積的少量改變對(duì)測(cè)定結(jié)果未見影響。

    2.2.4有關(guān)腐敗檢材的測(cè)定

    近些年,關(guān)于腐敗檢材CO中毒的檢驗(yàn)經(jīng)常有,也有關(guān)于尸體中CO的分布及代謝的研究報(bào)道。[6]文獻(xiàn)中建立的家兔CO中毒致死模型中,取中毒的新鮮血和室溫、4℃、-20℃下放置45天的腐敗血進(jìn)行間斷性的HS-GC-MS測(cè)定,盡管室溫放置的檢材均已發(fā)黑變臭,但45天后仍能檢測(cè)到CO含量最低為8.1%。[1、3]盡管這樣的數(shù)據(jù)不能解釋CO的產(chǎn)生是由于吸入還是由于死后微生物的分解所產(chǎn)生,但至少說明腐敗的血液和CO含量低于10%的檢材血液仍能用HS-GC-MS法進(jìn)行測(cè)定。此外,還要提醒的是較低含量的CO鑒定,在出具檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)要慎重,長(zhǎng)期吸煙的人、交通警察、部分地區(qū)的女性,其體內(nèi)CO的含量也接近10%。[7]

    2.3HS-GC-MS法與分光光度法比較

    選擇5份一氧化碳中毒檢材,HS-GC-MS分析時(shí)按照1.3.2和1.3.3的操作,分光光度法分析時(shí)按照《中國(guó)刑事科學(xué)技術(shù)大全毒物與毒品檢驗(yàn)》[8]中的一氧化碳測(cè)定法操作,結(jié)果如表所示。

    表 不同方法測(cè)定中毒檢材血液中一氧化碳含量(%)

    結(jié)果表明,對(duì)于一氧化碳中毒含量在50-60%時(shí),幾種方法測(cè)定結(jié)果差別不大,通常這一濃度也是判定一氧化碳中毒死亡原因的濃度,但當(dāng)檢材保存不當(dāng)、中毒量濃度不高時(shí),幾種方法差別較大,另外分光光度法無法對(duì)凝固的、腐敗的血液,臟器檢材進(jìn)行測(cè)定。

    綜上,一氧化碳中毒血的HS-GC-MS法檢測(cè)是一種相對(duì)穩(wěn)定的測(cè)定方法,其線性范圍較寬,更適合于血液、臟器、組織等檢材操作,但HS-GC-MS法測(cè)定的是血液中的總一氧化碳的含量,不排除組織等檢材中微量的、正常水平的一氧化碳的干擾。

    [1]郝紅霞,于忠山,王炯,等.頂空氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定腐敗血、肝檢材中CO[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2006,21(6):340-341.

    [2]于忠山.頂空氣相色譜法測(cè)定生物組織中的一氧化碳[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,1992,7(3):155-158.

    [3]Hao H,Zhou H,Liu X,etal.An accurate method formicroanalysisofcarbon monoxidein putridpostmortem blood by head-space gaschromatography-mass spectro metry(HS/GC/MS)[J].Forensic Sci Int.,2013,229(1-3): 116-121.

    [4]Varlet V,De Croutte EL,Augsburger M,et al. Accuracy profile validation of a new method for carbon monoxide measurement in the humanblood using headspace-gaschromatography-massspectrometry (HS-GC-MS)[J].J Chromatogr B, 2012, 880(1): 125-131.

    [5]陳燾.毒理學(xué)教材[M].第2版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:78-82.

    [6]Vassiliki A.Boumba,Theodore Vougiouklakis. Evaluation of the Methods Used for Carboxyhemoglobin Analysis in Postmortem Blood[J].International Journal of Toxicology,2005,24:275-281.

    [7]王海玲,李君,王利民.唐山市交通廢氣污染對(duì)交通警察HBCO飽和度的影響[J].中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué),2004,13(2):79-80.

    [8]劉文.中國(guó)刑事科學(xué)技術(shù)大全(毒品和毒物檢驗(yàn))[M].北京:中國(guó)人民公安大學(xué)出版社,2003:698-700.

    (責(zé)任編輯:于萍)

    D918.93

    A

    2095-7939(2015)01-0075-03

    2014-10-27

    張婷(1975-),女,遼寧沈陽人,中國(guó)刑警學(xué)院法化學(xué)系講師,碩士,主要從事刑事毒物毒品分析研究。

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