液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物

黃華發(fā)，張建平，黃朝章，謝衛(wèi)，鄧其馨，吳清輝，劉秀彩，葉仲力，劉澤春

福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廈門集美濱水路298號361021

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物

黃華發(fā)，張建平，黃朝章，謝衛(wèi)，鄧其馨，吳清輝，劉秀彩，葉仲力，劉澤春

福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廈門集美濱水路298號361021

建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物的方法。樣品用甲醇做萃取劑，經(jīng)渦旋振蕩，C8液相色譜柱分離，串聯(lián)質(zhì)譜儀MRM模式檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.05～l0mg/L范圍內(nèi)線性良好，定量限分別為2.5 μg/L、2.8 μg/L，回收率分別為95.2%、92.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%。該方法操作簡單、效率高、適合推廣運用。

液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法；再造煙葉；甲基異噻唑啉酮；甲基氯異噻唑啉酮

甲基異噻唑啉酮及其氯代物，俗稱卡松，活性成分為5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(甲基氯異噻唑啉酮，CMI)、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(甲基異噻唑啉酮，MI)，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。廣泛用于化妝品、個人護理品、涂料等行業(yè)，作為防腐殺菌劑，保護產(chǎn)品免受微生物污染，延長產(chǎn)品壽命[1-2]。

圖l 2種異噻唑啉酮類防腐劑的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural representation for MI and CMI

但是，暴露在甲基異噻唑啉酮類的環(huán)境中會存在健康隱患。研究發(fā)現(xiàn)甲基異噻唑啉酮類具有一定的細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，與皮膚接觸會產(chǎn)生過敏反應(yīng)，吸入、不慎吞咽對人體有害[3-5]。我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版）中規(guī)定甲基異噻唑啉酮在化妝品中最大允許使用濃度為0.01%[6]。

再造煙葉在使用的過程中為了防止霉變，減少損失，也可能在其中加入了甲基異噻唑啉酮及其氯代物，而在卷煙燃燒過程中進(jìn)入人體，對人體產(chǎn)生危害。因此，對再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮類的含量進(jìn)行測定和限定是十分必要的。

目前，對甲基異噻唑啉酮類的檢測方法主要有分光光度法[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、液相色譜[10-14]]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[15]。其中，液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法更適用于高沸點或熱穩(wěn)定性差等物質(zhì)的分離檢測，同時隨著色譜技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器普及率也較高，樣品預(yù)處理也相對簡單。因此，本文采用甲醇做萃取劑，經(jīng)渦旋振蕩，C8液相色譜柱分離，串聯(lián)質(zhì)譜儀MRM模式檢測，外標(biāo)法定量的方式，建立適用于再造煙葉中甲基異噻唑啉酮及其氯代物的定量分析檢測方法，為卷煙安全性評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗所用再造煙葉樣品分別由福建金閩、廣東金科、云南瑞升公司提供，按YC/T 31制備樣品并測定水分。

5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98.2%，Dr Ehrenstorfer GmbH），2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99.5%，Dr Ehrenstorfer GmbH），避光貯存于0℃～4℃條件下；色譜純丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲醇；分析純無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉；N-丙基乙二胺鍵合固相（PSA）吸附劑、碳18（C18E）吸附劑、石墨化炭黑（GCB）吸附劑（均購自美國Supelco公司）；水（符合GB/T6682中一級水的規(guī)定）。

Agilent1290高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB5500三重四級桿質(zhì)譜儀( 美國 Applied Biosystems SCIEX公司， 配備電噴霧離子源（ESI）)；VX-200漩渦混合振蕩儀（美國Labnet公司）；Sigma1-14高速離心機（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；AG104型電子天平（感量：0.0001 g，瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.2 儀器條件

LC條 件：進(jìn)樣量：5μL；色譜柱：Agilent ZORBAX 300SB-C8（規(guī)格為 2.1×100 mm,1.8 μm）；流動相：A：甲醇，B：水；梯度洗脫程序：0～4min甲醇：水=2:8，4～6min甲醇：水=9:1，6～8min甲醇：水=2:8，流速：250 μL/min，柱溫：40℃。

MS/MS條件：電噴霧正離子掃描(ESI(+))；電壓為4 000 V；碰撞氣為高純氮氣，碰撞氣壓力為0.20 Pa(1.5 mTorr)；鞘氣為氮氣，壓力為6.00kPa(45 Torr)；毛細(xì)管溫度為350 ℃；監(jiān)測模式為多級反應(yīng)監(jiān)控(multiple reaction monitoring,MRM)模式，質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.1 MS/MS acquisition parameters

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.1 mg)甲基異噻唑啉酮及其氯代物標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；準(zhǔn)確移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度均為0.05、0.l0、0.50、1、5、l0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 試樣處理

稱取約2 g樣品于50 mL具蓋離心管中，精確至0.1 mg，加入10 mL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤，靜置10 min。

移取10 mL甲醇到離心管中，并置于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min速率振蕩2 min。

在離心管中分別加入4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，立即于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min速度振蕩2 min，以防止無水硫酸鎂遇水反應(yīng)造成局部過熱并結(jié)塊，然后以4000 r/min離心5 min。

移取1.5 mL樣品提取液上層清液于2 mL離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂、50 mgN-丙基乙二胺鍵合固相（PSA）吸附劑，于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min 速率振蕩2 min，以4000 r/min 離心5 min，收集上清液，待檢測分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件

MI和CMI的結(jié)構(gòu)中均有含氮基團，有利于結(jié)合質(zhì)子得到正離子，因此選擇正離子模式進(jìn)行檢測。將質(zhì)量濃度為5.0 mg/L的MI和CMI標(biāo)準(zhǔn)品通過注射泵引入離子源，在不加碰撞氣壓力的情況下進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(Qt掃描)，結(jié)果表明這2種化合物的最強峰均為其準(zhǔn)分子離子峰，因此選擇準(zhǔn)分子離子[M+H]+為母離子，通過優(yōu)化噴霧電壓、離子傳輸管溫度、鞘氣壓力、輔助氣壓力、透鏡補償電壓等參數(shù)使得母離子強度最大。之后選擇碰撞氣壓力0.20 Pa，分別對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片的離子信息，找到強度較大的3個子離子，優(yōu)化其碰撞能量，其中強度最大的一個子離子用作定量離子，另外兩個用作定性離子，得到的特征子離子和碰撞能量信息如表1所示。

2.2 液相色譜條件的選擇

C-18和C-8硅烷色譜柱是高效液相色譜（HPLC）中最常使用的色譜柱。MI和CMI極性大，采用正相極性柱需要很長的分離時間，由于本方法采用三重四級桿質(zhì)譜MRM模式進(jìn)行檢測，對色譜分離的要求較低，同時為了縮短檢測周期，因此最終采用反相非極性C8色譜柱為固定相。

分別選擇不同配比水相、有機相進(jìn)行比較，選用不同比例甲醇、水、乙腈作為流動相對試樣進(jìn)行分離檢測，實驗結(jié)果表明：選用甲醇和水作為流動相比用乙腈、水作為流動相或甲醇、水、乙腈混合流動相，分離效果更好、色譜峰更尖銳。因此選用甲醇、水作為為流動相；同時采用梯度洗脫程序：在MI和CMI出峰后，調(diào)高流動相中甲醇的比例，加快其它雜質(zhì)峰的洗脫，減少流動相消耗。MI和CMI的MRM色譜圖如圖2所示。

圖2 MI和CMI的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram for MI and CMI

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 萃取劑的選擇

研究表明，由于再造煙草樣品為含水率低的粉末，采用一定量的水潤濕有利于MI和CMI的提取。進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)，為了將2 g的煙末完全潤濕，水的體積大致在10 mL左右。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[10-15]表明，MI和CMI一般采用丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、水等溶劑定容，實驗分別采用丙酮、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、水和甲醇對再造煙葉進(jìn)行萃取。結(jié)果如圖3所示，MI和CMI在水和醇類中溶解度較好，綜合考慮，我們選擇甲醇作為提取溶劑。進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)稱樣量為2g、萃取劑甲醇的體積為10 mL時萃取效果最好。

圖3 不同溶劑的萃取效率Fig.3Extraction efficiency of different solvents

2.3.2 提取方式的選擇

采用不同的提取方式，一般不會對自由態(tài)提取目標(biāo)的回收率造成影響，只會存在提取時間的差異。漩渦振蕩是一種新興的提取方式，其振蕩頻次可達(dá)到2000 rpm，是普通旋轉(zhuǎn)振蕩的10倍，極大地縮短了振蕩時間、提高了萃取的效率，并被QuEChERS前處理方法所采納。因此，本文最終選用了漩渦振蕩來作為提取方式，而進(jìn)一步的實驗摸索發(fā)現(xiàn)2 min的振蕩時間已能使提取達(dá)到完全。

2.3.3 緩沖鹽體系的選擇

在QuEChERS前處理方法中，常用的鹽析試劑包有：

A：4gMgSO4+ 1gNaCl（無緩沖鹽）

B：4gMgSO4+ 1gNaCl + 1gNa3Cit·2H2O + 0.5gNa2HCit·1.5H2O（檸檬酸緩沖鹽體系）

C：4gMgSO4+ 1gNaOAc（醋酸緩沖鹽體系，提取溶劑中要加入1%體積的醋酸）

對不同的鹽析試劑包進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：C鹽析試劑包回收率最低，A鹽析試劑包結(jié)果不穩(wěn)定，B鹽析試劑包回收率最高。因此，本文最終選用了檸檬酸鹽緩沖體系。

2.3.4 凈化吸附劑的選擇

在QuEChERS前處理方法中，常用的凈化劑有PSA、C18E、GCB等。對不同凈化劑進(jìn)行考察，結(jié)果如圖4所示：PSA的凈化效果較好，且回收率較高。因此，本文最終選擇PSA作為凈化劑。

圖4 不同凈化劑的回收率比較Fig.4 Recovery rate comparison of different purification agent s

2.3.5 標(biāo)液及樣品穩(wěn)定性

考察放置時間、溫度等對甲基異噻唑啉酮及其氯代物檢測的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲基異噻唑啉酮及其氯代物化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，溫度及時間對測定結(jié)果影響不大。

2.4 方法的驗證

2.4.1 線性關(guān)系

配制MI、CMI質(zhì)量濃度均為0.05、0.l0、0.50、1、5、l0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對其分別進(jìn)行測定，以目標(biāo)物的峰面積Y，對其質(zhì)量濃度X(mg/L)進(jìn)行回歸分析，得到MI、CMI的線性回歸方程，結(jié)果如表2所示。按信噪比(S/N)大于10來確定MI和CMI的儀器定量限分別為 2.5 μg/L、2.8 μg/L。

表2 M1和CMI的線性回歸方程和決定系數(shù)Tab.2 Linear regression equation and coefficient of determinat ion for M1 and CMI

2.4.2 重復(fù)性實驗

為了考察方法的重復(fù)性，對一樣品重復(fù)測定，重復(fù)做3天，每天進(jìn)行了6次平行測定，結(jié)果如表3、4所示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%。

表3 MI重復(fù)性試驗Tab.3 Repetition test of MI

表4 CMI重復(fù)性試驗Tab.4 Repetition test of CMI

2.4.3 回收率實驗

在同一樣品中，按樣品質(zhì)量加入3個濃度水平的標(biāo)樣，混勻，各測定3次，結(jié)果如表5、6所示，回收率分別為95.2%、92.3%，符合化學(xué)檢測要求。

表5 MI回收率試驗Tab.5 Recovery rate test of MI

表6 CMI回收率試驗Tab.6 Recovery rate test of CMI

2.4.4 樣品的測定

按上述方法對20個再造煙葉樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表7所示，在部分樣品中檢出了甲基異噻唑啉酮及其氯代物，檢出率為30%，檢測值分別在0.314～4.589 mg/kg和0.286～2.365 mg/kg之間。并與常規(guī)的HPLC/PDA檢測方法進(jìn)行比對試驗，兩組檢測結(jié)果經(jīng)t檢驗后發(fā)現(xiàn)：t（MI）=0.479<1.812、t（CMI）=0.254<1.812 (置信區(qū)間小于0.05)，說明兩種檢測方法無顯著性差異；但是采用HPLC/PDA方法在9#、12#、17#、18#樣品中出現(xiàn)的目標(biāo)峰經(jīng)UPLC/MS/MS方法確認(rèn)為假陽性，說明UPLC/MS/MS法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物較HPLC/PDA法更為可靠。

表7 部分有檢出的樣品檢測結(jié)果Tab.7 Test results of some samples

3 結(jié)論

以QuEChERS為樣品前處理方法，建立了HPLC/MS/MS法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物的方法。該方法線性良好，決定系數(shù)r2>0.99，回收率分別為95.2%、92.3%，RSD<5%。

采用該方法在部分樣品中檢出了甲基異噻唑啉酮及其氯代物。該方法填補再造煙葉中甲基異噻唑啉酮及其氯代物檢測的技術(shù)空白，且操作簡單、效率高、適合應(yīng)用。

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Determination of Methylisothiazolinketone and its chlorides in reconstituted tobacco by HPLC/MS/MS

HUANG Huafa,ZHANG Jianping,HUANG Chaozhang,XIE Wei,DENG Qixin,WU Qinghui,LIU Xiucai,YE Zhongli,LIU Zechun

Technology Center of China Tobacco Fujian Industrial CO.,Ltd.,Xiamen 361021,Fujian,China

A HPLC/MS/MS chromatography method for the determination of methylisothiazoketone and methyl chloroisothiazole morphlinone in reconstituted tobacco was developed.Samples were extracted with methanol,separated on C8 column,and then detected by HPLC/MS/MS under MMR model.Good linearity was obtained between 0.05～l0 mg/L.,and the limits of detection were 2.5 μg/L for MI and 2.8 μg/L for CMI,and RSD was <5% and the recoveries were 95.2% for MI and 92.3% for CMI.The method proved simple,fast,accurate,reliable，and applicable to quantitative analysis．

HPLC/MS/MS；reconstituted tobacco；Methylisothiazolinketone；Methylchloroisothiazole Morphlinone

黃華發(fā)，張建平，黃朝章,等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定再造煙葉中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（3）

黃華發(fā)（1983—），本科，工程師，主要從事煙草化學(xué)研究，Tel：0592-3170716， Email:hhf10520@fjtic.cn

劉澤春（1976—），碩士，高級工程師，主要從事煙草化學(xué)研究，Tel：0592-3170718，Email:lzc10497@fjtic.cn

2014-12-17

: HUANG Huafa,ZHANG Jianping,HUANG Chaozhang,et al.Determination of Methylisothiazolinketone and its chlorides in reconstituted tobacco by HPLC/MS/MS [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)