GC-MS法分析不同部位仿野生與組培快繁鐵皮石斛中的揮發(fā)性成分

付 濤， 王志龍

（寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江寧波315502）

GC-MS法分析不同部位仿野生與組培快繁鐵皮石斛中的揮發(fā)性成分

付 濤， 王志龍*

（寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江寧波315502）

目的 分析仿野生與組織培養(yǎng)快速繁殖 （組培快繁）鐵皮石斛莖、根和葉中的揮發(fā)性成分。方法 鐵皮石斛莖、根和葉液氮研磨成粉，氣質(zhì)聯(lián)用 （GC-MS）儀分析提取液中的成分和其相對含有量。結(jié)果 鐵皮石斛中共鑒定出90種揮發(fā)成分，主要為醛類、醇類、酯類、萜烯類、酮類、烷烴與芳香烴及其衍生物。其中，仿野生鑒定出72種，莖中24種、根中29種、葉中19種；組培快繁鑒定出68種，莖中23種、根中29種、葉中16種。其共有成分在莖中有11種，根中有10種，葉中有5種。此外，萘在鐵皮石斛不同部位中的含有量都較高。結(jié)論 仿野生與組培快繁鐵皮石斛不同部位中揮發(fā)性成分的差異很大。

鐵皮石斛；仿野生；組培快繁；揮發(fā)性成分；莖；根；葉；GC-MS

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo為蘭科石斛屬多年生草本植物，分布于浙江、安徽、福建、湖南、廣西、四川和云南等地，又名“耳環(huán)石斛”，是我國名貴中藥材，在道家養(yǎng)生經(jīng)典 《道臧》中被譽(yù)為中華九大仙草之首，藥用價值遠(yuǎn)高于人參、鹿茸、靈芝等，在民間有 “仙草”

的美譽(yù)。鐵皮石斛含多糖、生物堿、聯(lián)芐衍生物、菲、黃酮、氨基酸、微量元素等成分，有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抗白內(nèi)障、抗衰老、抗菌等多種生物活性［1-6］。由于該植物對生長條件要求十分苛刻，加上人為長期無限制、掠奪性和毀滅性地采挖及不合理利用，近年來其野生資源已瀕臨絕跡，已被列入珍稀野生藥用植物［7］，現(xiàn)已采用組培快繁技術(shù)對其進(jìn)行繁殖，市場上銷售的多為組培快繁品種。隨著生活水平的提高，人們也逐漸開始關(guān)注養(yǎng)生問題，野生鐵皮石斛價格十分昂貴，藥效顯著，市場上對其需求量很大。目前，根據(jù)不同地區(qū)資源、氣候等特點(diǎn)，已有鐵皮石斛仿野生的不同種植模式，是很多科研人員、農(nóng)民或企事業(yè)單位員工正探索的工作，仿野生種植鐵皮石斛勢在必行。

浙江省是野生鐵皮石斛的分布地之一，如東部的鄞縣、天臺、仙居等。根據(jù)生長習(xí)性，鐵皮石斛栽培地宜選擇海拔100～1 000 m，年降雨量1 100～1 500 mm，生長季節(jié)溫度 20～25℃、冬季氣溫-3℃以上，相對濕度75%以上，無霜多霧，林間郁閉度0.6左右的陰涼、濕潤的常綠闊葉林。寧波奉化市溪口地區(qū)地處沿海、江南，四面環(huán)山，樹林覆蓋率廣，氣候條件溫暖濕潤，年平均溫度在15～20℃，年降水量在1 200～1 800 mm，土壤深厚肥沃，比較符合鐵皮石斛仿野生種植的基本條件。

鐵皮石斛全身都是寶，但目前除了莖之外，對該植物葉、根或花的研究報道較少，尚未大面積推廣應(yīng)用。鐵皮石斛葉中含有少量石斛多糖、生物堿，可以起到降火消署的作用，目前已有人將其做成石斛葉茶，但加工不易，產(chǎn)量不理想；傳統(tǒng)上，優(yōu)質(zhì)鐵皮楓斗以外觀 “龍頭鳳尾”者為優(yōu)，其中 “尾”即為根，因此根部的營養(yǎng)成分并不亞于莖，但單獨(dú)對根化學(xué)成分的研究鮮有于報道。近年來，由于GC-MS被廣泛使用，不同植物中揮發(fā)性成分的研究如火如荼，其組成和含有量也逐漸成為評價植物品質(zhì)優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。迄今為止，鐵皮石斛揮發(fā)性成分的研究相對滯后，尤其是對不同部位 （根、莖和葉）中揮發(fā)性成分的關(guān)注更少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過分析仿野生與組培快繁鐵皮石斛不同部位中揮發(fā)性成分的差異，來評價兩者的品質(zhì)差異，為優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛的篩選提供重要的品質(zhì)指標(biāo)，而且對該植物資源的合理利用也具有十分重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料 仿野生、組培快繁鐵皮石斛均為2年生，來自寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院溫室大棚和仿野生種植基地 （經(jīng)度121.40、緯度29.65）。道地鐵皮石斛通過組培穴盤苗，選擇健壯、無病蟲害者，以2年生新莖作繁殖用，采用莖尖 （節(jié)）作為繁殖材料的無性繁殖途徑。組培苗2個月后再經(jīng)露地?zé)捗?個月，移栽到穴盤中，半年后將部分穴盤苗移植到溫室大棚的容器花盆中，進(jìn)行組培快繁管理，而另一部分進(jìn)行仿野生種植。組培快繁需要定期澆水、追肥、整枝等，此外每月還要噴適量殺菌劑以防治病蟲害；仿野生種植不施肥、不用農(nóng)藥，但若空氣濕度過小，則需澆水保濕。

1.2 主要試劑與儀器 氯化鈉為分析純；液氮。HP7890B GC system/5977A MSD GC-MS聯(lián)用儀（美國安捷倫科技公司）；手動固相微萃取裝置，萃取纖維為7.5μm CAR/PDMS（美國Supleco公司）；Mettler Toledo電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MLLI-Q-超純水儀（美國Millipore公司）；加熱磁力攪拌器；液氮罐。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取（SPME）條件 分別選取2年生仿野生和組培快繁鐵皮石斛的莖、葉和根，液氮研磨成粉，迅速稱取5 g左右，裝入固相微萃取專用采樣瓶中，加入超純水2 m L，插入裝有7.5μm CAR/PDMS纖維頭的手動進(jìn)樣器，磁力攪拌速度為1 000 r/min，60℃下頂空萃取40 min后取出，快速插入色譜儀進(jìn)樣口 （250℃）中，解吸附5 min。

1.3.2 GC條件 色譜柱為Agilent 19091S-433：93.92873 HP-5MS 5%Phenyl Methyl silox-60℃-325℃（30 m×250μm×0.25μm）；柱溫50℃；進(jìn)樣口溫度 250℃；柱內(nèi)載氣體積流量 1.0 mL/min；載氣為高純氦氣 （99.999%）；汽化室溫度250℃，柱前壓7.62 psi；升溫程序?yàn)閺?0℃開始，保持1 min，以4℃/min速率升至240℃，保持2 min；不分流進(jìn)樣。

1.3.3 MS條件 電子轟擊離子源為EI；離子源溫度230℃；接口溫度250℃；電子能量70 eV；MS四級桿溫度150℃；調(diào)諧EMV 1 149；溶劑延時2.6 min；掃描范圍15～500 Amu。

1.4 數(shù)據(jù)處理 通過HP chemstation檢索Nist05和wiley 275質(zhì)譜圖庫，同時結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確認(rèn)仿野生和組培快繁鐵皮石斛莖、葉和根中的揮發(fā)性化學(xué)成分。然后，通過HP chemstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法計算出各化學(xué)成分的相對百

分含有量。

2 結(jié)果

鐵皮石斛中共檢測到90種揮發(fā)性成分，包括醛類 （10種）、醇類 （13種）、酯類 （11種）、萜烯類 （13種）、酮類 （14種）、烷烴與芳香烴及其衍生物 （20種）和其他 （9種）；其中仿野生檢測到72種，組培快繁檢測到68種。仿野生莖中有24種，在這7類物質(zhì)中分別占1、4、3、1、3、11和1種，而組培快繁莖中有23種，分別占4、5、 3、1、2、8和0種；仿野生根中有29種，分別占3、6、3、5、5、5和2種，而組培快繁莖中有29種，分別占4、5、1、4、6、7和2種；仿野生葉中有19種，分別占2、1、2、1、4、4和5種，而組培快繁葉中有16種，分別占2、2、5、1、2、3和1種。具體見表1和表2，仿野生和組培快繁鐵皮石斛莖、根和葉中揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖見圖1。

表1 仿野生與組培快繁鐵皮石斛不同部位中揮發(fā)性成分的種類及相對含有量Tab.1 K inds and relative con tents of volatile constituents in d ifferent parts of im itative w ild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale

圖1 仿野生和組培快繁鐵皮石斛莖、根和葉中揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chrom atogram s of volatile constituents in stem s，roots and leaves of im itativew ild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale

表2 仿野生與組培快繁鐵皮石斛不同部位中揮發(fā)性成分及其相對含有量Tab.2 Volatile constituents and their relative con tents in d ifferent parts of im itativew ild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale

續(xù)表2

續(xù)表2

2.1 相同部位揮發(fā)性成分種類以及主要成分含有量的比較 由表2可知，仿野生鐵皮石斛莖中烷烴與芳香烴及其衍生物的含有量最高 （55.17%），其次是酯類 （27.76%）、醇類 （6.55%）、酮類（4.4%）、醛類 （3.97%）和萜烯類 （1.06%），其它占1.08%。其中，相對含有量最高的前5位依次是1，6-二 （丙炔氧基）己烷 （30.49%）、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯 （14.44%）、萘（11.19%）、鄰苯二甲酸二丁酯 （9.02%）和鄰苯二甲酸雙十二酯 （4.30%）；組培快繁莖中各類成分的含有量相對均衡，烷烴與芳香烴及其衍生物最高 （26.18%），其次是醇類 （23.71%）、酯類（17.89%）、酮類 （17.38%）、醛類 （13.11%）和萜烯類 （1.71%），其它成分無。其中，相對含有量最高的前5位依次是1-棕櫚醇 （18.20%）、1-（4-溴化丁基）-2-氮已環(huán)酮 （15.11%）、萘（11.46%）、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯（8.44%）和鄰苯二甲酸二丁酯 （6.82%）。

仿野生鐵皮石斛根中各類成分的含有量也相對均衡，烷烴與芳香烴及其衍生物最高 （25.00%），其次是醛類 （20.77%）、酮類 （20.00%）、醇類（14.45%）、萜烯類 （12.52%）、酯類 （3.70%），其它占3.55%。其中，相對含有量最高的前5位依次是萘 （12.51%）、2-十一烯醛 （10.30%）、賴百當(dāng)-8（20），12，14-三烯 （9.01%）、1-（4-溴化丁基）-2-氮已環(huán)酮 （7.27%）和壬醛（6.07%）；組培快繁根中醇類的含有量最高（38.85%），其次是酮類 （20.19%）、烷烴與芳香烴及其衍生物 （17.20%）、醛類 （11.62%）、萜烯類 （9.61%）、酯類 （0.97%），其它占1.55%。其中，相對含有量最高的前5位依次是1-棕櫚醇（26.87%）、 萘 （6.26%）、 2-十 一 烯 醛（5.32%）、9，9-二甲氧基二環(huán)［3.3.1］壬-2，4-二酮 （5.10%）和α-異甲基紫羅蘭酮 （4.25%）。

仿野生鐵皮石斛葉中醛類含有量最高（66.18%），其次是酮類 （14.36%）、烷烴與芳香烴及其衍生物 （6.22%）、醇類 （4.31%）、酯類（1.15%）、萜烯類 （0.41%）、其它占7.35%。其中，相對含有量最高的前5位依次是反式-2-己烯醛 （62.44%）、3，5-二叔丁基-4-羥基-2，4-環(huán)己二烯-1-酮 （9.68%）、萘 （4.53%）、環(huán)十二醇（4.31%）、反式-4-羰基己-2-烯醛 （3.74%）；組

培快繁葉中也是醛類的含有量最高 （58.64%），其次是酯類 （12.90%）、酮類 （10.10%）、烷烴與芳香烴及其衍生物 （9.72%）、醇類 （3.85%）、萜烯類 （3.12%），其它占1.62%。其中，相對含有量最高的前 5位依次是反式-2-己烯醛（52.89%）、反式-香葉基丙酮 （6.53%）、萘（6.23%）、反式-2-己烯苯甲酸酯 （5.86%）和壬醛（5.75%）。

2.2 相同部位共有成分含有量比較 由表可知，仿野生和組培快繁鐵皮石斛莖中有11種共有成分（分別占總揮發(fā)性成分的50.30%、73.19%），為十三醛、1-棕櫚醇、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯、鄰苯二甲酸二丁酯、1-（4-溴化丁基）-2-氮已環(huán)酮、萘、2-甲基-萘、1-亞乙基-1H-茚、2，6，10-三甲基-十二烷、1-（1，5-二甲基己基）-4-（4-甲代戊基）環(huán)己烷和2，6，10，14-四甲基十七烷，約占總數(shù)的一半，但含有量差異較大；兩者根中有10種 （分別占58.07%、55.12%），為2，6-辛二烯-4，5-二醇、2-十一烯醛、反式-11，13-十四碳二烯-1-醇、1-棕櫚醇、反式-香葉基丙酮、1-（4-溴化丁基）-2-氮已環(huán)酮、萘、1-亞乙基-1H-茚、2，6，10-三甲基十四烷和0-葵基羥胺，約占總數(shù)的1/3，具體種類成分差異較大；兩者葉中有5種 （分別占74.82%、66.71%），為反式-2-己烯醛、L-α-萜品醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、反式-β-紫羅酮和萘，約占總數(shù)的1/4～1/3，具體種類成分差異也較大。

2.3 不同部位共有成分含有量比較 由表可知，仿野生鐵皮石斛莖、根和葉中成分的差異非常大，其莖與根有7種共有成分 （分別占總揮發(fā)性成分的33.60%、33.46%），為反式-9-十六碳烯醇、1-棕櫚醇、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯、1-（4-溴化丁基）-2-氮已環(huán)酮、萘、1-亞乙基-1H-茚和2，2′，5，5′-四甲基-1，1′-聯(lián)苯；莖與葉有7種（分別占20.06%、15.52%），為環(huán)十二醇、反式-β-紫羅酮、順式-香葉基丙酮、萘、2-甲基-萘、6-乙基-2-甲基癸烷和1，6：3，4-Dianhydro-2-deoxy-β-D-lyxo-hexopyranose；根和葉僅有1種（分別占12.51%、4.53%），為萘；莖、根和葉僅有1種（分別占11.19%、12.51%、4.53%），為萘。組培快繁鐵皮石斛莖、根和葉中成分的差異也很顯著，莖與根有5種 （分別占49.04%、41.92%），為2，6-辛二烯-4，5-二醇、1-棕櫚醇、1-（4-溴化丁基）-2-氮已環(huán)酮、萘和1-亞乙基-1H-茚；莖與葉有4種（分別占22.88%、14.94%），為壬醛、1， 5-二甲基-1-乙烯基-4-己烯基丁酸酯、萘和1-亞乙基-1H-茚；根與葉有 4種 （分別占 14.70%、16.75%），為環(huán)十二醇、反式-香葉基丙酮、萘和1-亞乙基-1H-茚；莖、根和葉有 2種 （分別占14.89%、8.68%、7.66%），為萘和1-亞乙基-1H-茚。

3 討論

楊柳等［8］采用正己烷蒸餾法，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛莖中的揮發(fā)油成分主要為烷烴、酸、烯烴、酯、甾醇、二萜、蒽醌類等?？德?lián)偉等［9-10］采用固相微萃取法，發(fā)現(xiàn)其主要含醛、醇、酮、烯烴和酯烴類化合物，還指出鐵皮石斛愈傷組織的主要揮發(fā)性成分是烯烴類物質(zhì)，而試管苗則為一些醛類物質(zhì)。邵進(jìn)明等［11］采用固相微萃取法，發(fā)現(xiàn)2年生鐵皮石斛莖、葉中的揮發(fā)性成分均含檸檬油精、壬醛、順-3-己烯醇等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該植物中的揮發(fā)性成分主要包括醛類、醇類、酯類、萜烯類、酮類、烷烴類以及芳香烴及其衍生物等，這與先前研究基本一致，由于采取固相微萃取法，因此所得揮發(fā)性成分大多是低沸點(diǎn)化合物，而楊柳等［8］采用水蒸氣蒸餾法，所得大多是較高沸點(diǎn)化合物。筆者先前也采用水蒸氣蒸餾法對鐵皮石斛試管苗不同部位進(jìn)行了分析 （數(shù)據(jù)未公布），發(fā)現(xiàn)與楊柳等［8］非常類似，不含醛類等低沸點(diǎn)化合物。因此，采用不同的方法，其結(jié)果也不盡相同。

另外，仿野生 （72種）與組培快繁 （68種）鐵皮石斛成分的種類相當(dāng)，但具體成分和相對含有量差異較大。仿野生莖中烷烴類和芳香烴及其衍生物占絕大多數(shù) （55.17%），酯類含有量較高，而其余成分較低；組培快繁無明顯突出成分，相對平均，除萜烯類含有量較低外，其余成分均較高。兩者根中除酯類物質(zhì)含有量均較低外，其余成分均較高。兩者葉中醛類物質(zhì)占絕大多數(shù) （分別為66.18%、58.64%），其中均以反式-2-己烯醛為最主要物質(zhì) （相對含有量分別為 62.44%、52.89%），其次為黃酮類、酯類物質(zhì)，而其余成分均較低。由此可見，由于生長環(huán)境的差異，鐵皮石斛不同部位中的揮發(fā)性成分也有很大差異，但總體而言，莖中揮發(fā)性成分以烷烴類以及芳香烴及其衍生物、酯類、醇類等為主；根中比較平均，但以黃酮類、醇類等為主；葉中則以醛類 （反式-2-己烯醛）為主。因此，本實(shí)驗(yàn)為鐵皮石斛不同部位的合理利用提供了一定的理論基礎(chǔ)，針對鐵皮石斛莖、根和葉中揮發(fā)性成分的不同，可以對其進(jìn)行合

理的應(yīng)用，避免珍貴資源的浪費(fèi)。

揮發(fā)性成分主要屬于次生代謝產(chǎn)物，在植物體內(nèi)含有量較少，因此受到環(huán)境等因素的影響較大，這也是仿野生和組培快繁相同部位揮發(fā)性成分差異較大的重要原因，但無論是仿野生還是組培快繁，其不同部位揮發(fā)性成分的差異也很懸殊，這可能是不同部位器官功能基因選擇性表達(dá)的結(jié)果，亦可能與其物質(zhì)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)，有待作進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，萘在仿野生和組培快繁的莖、根和葉中均有，似乎也不受環(huán)境等因素的影響，而且含有量較高，均位于揮發(fā)性成分的前5位，可能與其抗性有緊密聯(lián)系，因此可以把萘作為鑒定鐵皮石斛的一種重要物質(zhì)以供參考。C6醛或醇是植物遭受昆蟲取食后誘導(dǎo)釋放的一類物質(zhì)，一般具有生物殺傷性能，可防止繼續(xù)遭受昆蟲的侵食，此外還具有抑菌、殺菌等作用［12］。仿野生葉中的 C6醛化合物（反式-2-己烯醛、反式-4-羰基己-2-烯醛，相對含有量分別為62.44%、3.44%）顯著高于組培快繁（反式-2-己烯醛，52.89%），說明鐵皮石斛葉在自然條件下更容易遭受昆蟲侵食，其中C6醛化合物的合成顯著提高，以提高其抗逆性和防御性。因此，葉還可加工制作成香皂、洗手液、洗衣粉等殺菌抑菌生活用品。

植物的特征香氣成分是引起植物特有香味嗅感的物質(zhì)，即使含有量很低，也對植物品質(zhì)起著重要作用。Yang等［13］對蜂膠的研究表明，人體嗅覺對化合物氣味的感知與其含有量和氣味閾值都有關(guān)，含有量高的化合物可能由于氣味閾值高而不易被感知［14］，譬如與植物青香味有關(guān)的反式-2-己烯醛，其閾值為0.02 mg/kg，微量時就可以感覺到它的存在，故一些含有量不是十分顯著的化合物對鐵皮石斛莖、根和葉氣味的形成起到了一定作用。植物香氣的產(chǎn)生非常復(fù)雜，可能是由幾種主要特征香氣成分決定的，也可能是由各種成分通過融合、疊加、掩蓋等相互作用表現(xiàn)出來的［15］。無論是仿野生還是組培快繁，鐵皮石斛莖、葉中揮發(fā)性成分的種類均明顯高于葉，因此傳統(tǒng)上以 “龍頭鳳尾”者為優(yōu)有一定道理。由于生長環(huán)境的差異，鐵皮石斛不同部位揮發(fā)性成分的種類和含有量均發(fā)生了較大的差異，可能與其對環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)，但該植物中許多化學(xué)成分的功能尚不清楚，因此本地仿野生種植是否明顯提高了鐵皮石斛的品質(zhì)需有待作進(jìn)一步研究。

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Analysis of volatile constituents in different parts of im itativewild and tissue culture and rapid propagation of Dendrobium officinale by GC-MS

FU Tao， WANG Zhi-long*

（Ningbo City College of Vocational Technology，Ningbo 3155O2，China）

AIM To analyze the volatile constituents in stems，roots and leaves of imitative wild and tissue culture and rapid propagation of Dendrobium officinale.METHODS The stems，roots and leaves of imitative wild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale were ground to fine powder in liquid nitrogen，the analyses of extractswere carried out on gas chromatography-mass spectrum（GC-MS）.RESULTS Total 90 kinds of volatile constituents were identified in D.officinale，most of which were aldehydes，alcohols，esters，terpenes，ketones，alkanes，aromatic hydrocarbons and their derivatives.Among them，72 kinds were identified in imitative wild of D.officinale，containing 24，29 and 19 kinds in stems，roots and leaves，respectively，while68 kindswere identified in tissue culture and rapid propagation of D.officinale，containing 23，29 and 16 kinds in stems，roots and leaves，respectively.There were 11，10 and 5 kinds of common constituents in stems，roots and leaves，respectively.In addition，the contentof naphthalene was high in different parts of D.officinale.CONCLUSION There are considerable differences in volatile constituents in different parts of imitative wild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale.

Dendrobium officinale；imitative wild；tissue culture and rapid propagation；volatile constituents；stems；roots；leaves；GC-MS

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2702-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.028

2015-03-18

浙江省教育廳科研項目 （Y201533193）；寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)重點(diǎn)項目 （ZZX15064）

付 濤 （1988—），男，碩士，主要從事園林園藝植物育種研究。Tel：15728035334，E-mail：819969334@qq.com

*通信作者：王志龍 （1971—），男，教授，主要從事植物資源保護(hù)教學(xué)與研究。Tel：（0574）88861001，E-mail：wangzhl01@163.com