靶細(xì)胞提取聯(lián)用HPLC-TOF MS法分析丹紅注射液中的活性成分

呂燕妮， 錢貽崧， 付龍生*

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江西南昌330046；2.南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江西南昌330031）

靶細(xì)胞提取聯(lián)用HPLC-TOF MS法分析丹紅注射液中的活性成分

呂燕妮1， 錢貽崧2， 付龍生1*

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江西南昌330046；2.南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江西南昌330031）

目的 應(yīng)用靶細(xì)胞提取聯(lián)用高效液相飛行時間質(zhì)譜（HPLC-TOFMS）法分析丹紅注射液中的活性成分，并對其防治疾病的分子機(jī)制做生物信息學(xué)預(yù)測。方法 將小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2細(xì)胞）和丹紅注射液共孵育，HPLC-TOFMS法對所得的細(xì)胞破碎液進(jìn)行分析，然后挖掘靶細(xì)胞結(jié)合成分中與腦卒中相關(guān)的蛋白和信號通路。結(jié)果 從BV2細(xì)胞破碎液中檢測到丹參素、原兒茶醛、6-羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B這5種丹紅注射液中的水溶性成分，再構(gòu)建靶細(xì)胞結(jié)合成分-蛋白網(wǎng)絡(luò)，映射在Biocart信號通路中，包括Toll受體信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞凋亡、MAPK信號通路等，關(guān)聯(lián)腦卒中發(fā)病機(jī)制的炎癥、氧化應(yīng)激方面。結(jié)論 該研究初步闡釋了丹紅注射液與腦卒中信號通路的關(guān)聯(lián)。

丹紅注射液；活性成分；BV2細(xì)胞；腦卒中；HPLC-TOFMS；生物信息學(xué)

丹紅注射液為傳統(tǒng)中藥丹參與紅花的復(fù)方制劑，具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)等功效，臨床主適應(yīng)癥為中風(fēng)、冠心病、缺血性腦病等，其療效確切，已被醫(yī)學(xué)界普遍接受［1］。在之前對丹紅注射液信息數(shù)據(jù)庫中成分的信息學(xué)研究時發(fā)現(xiàn)［2］，其與固有免疫途徑密切相關(guān)。近年來，固有免疫途徑和腦缺血再灌注的關(guān)聯(lián)已成為國際研究熱點［3］，腦缺血再灌注后引起的機(jī)體不協(xié)調(diào)與其釋放炎癥因子，

引起下游炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［4］。丹紅注射液的主適應(yīng)癥既為腦缺血再灌注，其靶蛋白又與固有免疫途徑相關(guān)，推測可能通過固有免疫途徑來防治腦缺血再灌注。小膠質(zhì)細(xì)胞 （BV2細(xì)胞）［5］為固有免疫途徑的感應(yīng)細(xì)胞，腦缺血再灌注后啟動固有免疫途徑，BV2細(xì)胞活化，釋放下游炎癥信號因子，引起神經(jīng)元損傷。本實驗選取BV2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，基于藥物與細(xì)胞膜上的受體、酶等結(jié)合，或直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部而發(fā)揮作用的原理，采用高效液相飛行時間質(zhì)譜（HPLC-TOF MS）法［6-7］對共孵育后的細(xì)胞破碎液進(jìn)行分析，期冀發(fā)現(xiàn)丹紅注射液在BV2靶細(xì)胞中的結(jié)合成分［8-10］。

中藥復(fù)方由于其成分復(fù)雜性，在治療多基因的復(fù)雜性疾病時，需要干預(yù)多個靶點和信號通路，以網(wǎng)絡(luò)形式達(dá)到理想的藥物治療效果［11］。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等生物信息學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生［12］，其通過構(gòu)建中藥化學(xué)成分與體內(nèi)靶標(biāo)的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，為藥效成分和靶標(biāo)篩選提供了新的研究手段。本實驗進(jìn)一步對丹紅注射液在BV2靶細(xì)胞中的結(jié)合成分進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定其中成分具體發(fā)揮作用的蛋白和信號通路，有助于藥物活性成分的篩選及藥效機(jī)理的研究，可為腦缺血再灌注機(jī)制提供新的研究途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 自動純水機(jī)（美國Milipore公司）；超低溫冰箱（美國Thermo公司）；Z-323 K冷凍干燥機(jī)（德國Herm Le公司）；Agilent 1100 LC/ TOFMS系統(tǒng)，包括在線真空脫氣機(jī)、高壓二元梯度泵、盤式自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列DAD檢測器、電噴霧ESI離子源（美國Agilent公司）。數(shù)據(jù)采集及處理采用Agilent HPLC-TOF MS Software Ver.A.01.00及PE Sciex Analyst QS 1.1分析軟件。甲醇為色譜純 （南京化學(xué)試劑股份有限公司）；乙腈為色譜純 （美國 Tedia公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；小牛血清（美國Hyclone公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2細(xì)胞），用DMEM高糖培養(yǎng)基 （含10%小牛血清、青霉素以及鏈霉素）在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隔天更換，生長2～3 d后融合，磷酸鹽緩沖液 （PBS）洗滌兩次，加入新的培養(yǎng)基，將細(xì)胞輕輕吹下，形成細(xì)胞懸液后進(jìn)行計數(shù)。以1×105個/m L細(xì)胞密度進(jìn)行傳代，在倒置相差顯微鏡下觀察，選擇處于指數(shù)期狀態(tài)的細(xì)胞供實驗用。

1.2.2 靶細(xì)胞提取丹紅注射液中的成分 選擇處于指數(shù)生長期的BV2細(xì)胞，加入無血清的DMEM溶液，在37℃、5%CO2條件下同化1 h，棄除DMEM溶液，加入含終質(zhì)量濃度為6.25μL/L丹紅注射液的無血清的DMEM溶液，在37℃、5% CO2條件下與細(xì)胞共孵育24 h，倒掉藥液，用生理鹽水沖洗4次，取第4次洗脫液1 mL備用。洗滌后的細(xì)胞在-80℃下反復(fù)凍融3次，加乙醇10 mL破碎，破碎液減壓揮干，用超純水0.5 m L溶解，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。將第4次洗脫液和加藥后的細(xì)胞破碎液上清液進(jìn)HPLCTOFMS作檢測。然后，以同樣方法，用無血清的DMEM溶液代替藥液作空白細(xì)胞的破碎液。

1.2.3 色譜及質(zhì)譜條件 丹紅注射液 （批號為14081002，10 mL/支，菏澤步長制藥有限公司）用超純水按1∶5（V/V）稀釋，0.22μm濾膜過濾，取過濾液10μL，進(jìn)HPLC-TOF MS作分析。采用AlltimaTM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為0.4%甲酸水溶液 （A）-乙腈 （B），梯度洗脫（0～20 min，3%～12%B；20～30 min，12%～20%B；30～55 min，20%～38%B；55～75 min，38%～80%B）；體積流量1 m L/min。質(zhì)譜參數(shù)為負(fù)離子模式檢測，m/z100～3 000；干燥氣溫度320℃；體積流量8 L/min；霧化壓力40 psig；毛細(xì)管負(fù)離子模式；電壓3.5 kV；進(jìn)樣量10 μL。將加藥細(xì)胞破碎液和最后一次洗脫液的樣品經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，用HPLC-TOFMS檢測。

1.2.4 文本挖掘、丹紅注射液靶細(xì)胞結(jié)合成分-蛋白網(wǎng)絡(luò)及EKGG信號通路的映射 文本挖掘采用Agilent Literature Search（ALS）軟件，以丹紅注射液靶細(xì)胞結(jié)合成分的英文名為詞條，從文獻(xiàn)句子中解析出蛋白名，作為第一部分蛋白集［13-14］；在Genecards數(shù)據(jù)庫中搜索與腦卒中“stroke”相關(guān)的蛋白，作為第二部分蛋白集。然后，將兩部分蛋白集進(jìn)行交集，得到與兩者相關(guān)的蛋白集，并在Cytoscape軟件中建立丹紅注射液靶細(xì)胞結(jié)合成分-蛋白網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行Biocart信號通路的映射，得到相關(guān)信號通路。

2 結(jié)果與討論

2.1 空白對照組 丹紅注射液的總離子流圖見圖1，空白細(xì)胞破碎液的總離子圖 （TIC）見圖2A，由于未檢測到丹紅注射液中的成分，故排除空白細(xì)胞的干擾因素。第4次洗脫液的總離子流圖見圖

2B，未發(fā)現(xiàn)明顯響應(yīng)信號，說明細(xì)胞膜上的成分已沖洗干凈，確定下一步檢測成分應(yīng)為與細(xì)胞膜結(jié)合或進(jìn)入細(xì)胞的成分。

圖1 丹紅注射液的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of Danhong Injection

圖2 空白BV2細(xì)胞破碎液和第4次洗脫液的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of blank BV2 cell disruption sap and the fourth eluent

2.2 BV2細(xì)胞膜與丹紅注射液相互作用的研究

在加藥的BV2細(xì)胞破碎液中，用提取離子流圖定性鑒別丹紅注射液中丹參素、原兒茶醛、6-羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸這5種水溶性成分，見圖3。其中，保留時間13.5 min對應(yīng)6號峰，鑒定為丹參素；保留時間20.8 min對應(yīng)8號峰，鑒定為原兒茶醛；保留時間26.3 min對應(yīng)10號峰，鑒定為6-羥基紅花黃色素 A；保留時間46.5 min對應(yīng)23號峰，鑒定為迷迭香酸；保留時間53.2 min對應(yīng)25號峰，鑒定為丹酚酸B。另外，檢測到的成分未在空白對照組和加藥細(xì)胞最后一次洗脫液中發(fā)現(xiàn)，為細(xì)胞膜結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞的成分。

圖3 加藥后BV2細(xì)胞破碎液的總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of BV2 cell disruption sap after adm inistration

2.3 丹紅注射液靶細(xì)胞結(jié)合成分-蛋白網(wǎng)絡(luò)及信號通路的分析 在ALS系統(tǒng)中，分別以丹紅注射液中5個活性成分丹參素、原兒茶醛、6-羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸的英文名進(jìn)行搜索，分別得到丹參素蛋白918個、原兒茶醛蛋白524個、6-羥基紅花黃色素A蛋白256個A、迷迭香酸蛋白343個、丹酚酸B蛋白931個，去除重復(fù)后，共得到蛋白2 043個。在Genecards數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中，輸入 “stroke”后得到相關(guān)蛋白1 093個，將兩個系統(tǒng)所得到的蛋白進(jìn)行交集，最終得到與腦卒中相關(guān)的蛋白共54個。其中，丹參素蛋白24個、原兒茶醛蛋白23個、6-羥基紅花黃色素A蛋白12個A、迷迭香酸蛋白35個、丹酚酸蛋白37個，與蛋白都有相互作用。根據(jù)ALS系統(tǒng)所提供的蛋白間關(guān)聯(lián)，最終在Cytoscape軟件中可視化建立丹紅注射液靶細(xì)胞結(jié)合活性成分-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖4。將蛋白映射在Biocart信號通路上，包括Toll樣受體信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞凋亡信號通路、MAPK受體信號通路等。由圖可知，Toll樣受體通路及其蛋白TLR4、Myd88受體、NFκB信號通路及其蛋白NFκB1、RELA受體均涉及炎癥方面，IL6、CYP2C9、IL10蛋白所在的細(xì)胞因子通路亦涉及炎癥方面，MAPK14、MAPK8、MAPK9蛋白等MAPK信號通路涉及氧化應(yīng)激方面，MAPK8、FOS、JUN蛋白所在的神經(jīng)生長因子通路涉及神經(jīng)營養(yǎng)方面，而HMOX1、TP53、BCL2 L1蛋白所映射的細(xì)胞凋亡途徑涉及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡方面，它們都與腦卒中的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

3 討論

圖4 丹紅注射液靶細(xì)胞結(jié)合成分-蛋白信號通路網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Constituents combined w ith target cells-protein signaling pathway netw ork of Danhong Injection

中藥復(fù)方具有多成分、多靶標(biāo)的特點，研究其防治疾病的作用機(jī)制時，如何識別其活性成分，如何選取作用靶標(biāo)和信號通路進(jìn)行驗證，成為闡釋中藥復(fù)方作用機(jī)制的關(guān)鍵問題之一。對于活性成分不明確的中藥復(fù)方，可通過靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，并針對這些成分進(jìn)行有目的地分離和藥理活性篩選，為含有復(fù)雜成分的中藥藥效物質(zhì)研究提供新的思路。本實驗中，丹紅注射液與BV2靶細(xì)胞共孵育，HPLCTOFMS法對共孵育后的細(xì)胞破碎液進(jìn)行分析，篩選出丹紅注射液作用于BV2細(xì)胞的丹參素、原兒茶醛、6-羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸這5種活性成分，為進(jìn)一步研究中藥復(fù)方藥效提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

以上述5種活性成分及其靶標(biāo)構(gòu)建成分-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其相互間既有共同作用蛋白，又各有差異。如丹參素、原兒茶醛、丹酚酸可共同作用于ACE受體，丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B可共同作用于MAPK3受體，并且所有成分均可作用于NFκB1受體。6-羥基紅花黃色素A和和丹酚酸B雖共同作用于TLR4受體，然而前者可通過激活TLR4下游的MYD88受體而發(fā)揮作用，而后者可作用于BCL2L1受體關(guān)聯(lián)細(xì)胞凋亡途徑，另外原兒茶醛可作用于細(xì)胞間黏附分子-1 ICAM1受體而發(fā)揮作用。由此表明，以上5種活性成分既可通過共同蛋白發(fā)揮作用，也可通過其各自蛋白協(xié)同作用發(fā)揮防治疾病的功效，如丹參素［15］、6-羥基紅花黃色素A［16］、迷迭香酸［17］、丹酚酸B［18］均與腦缺血疾病關(guān)聯(lián)，原兒茶醛在心肌缺血再灌注損傷模型上有相關(guān)研究［19］，并且其作用的NOS2受體與腦卒中有潛在關(guān)聯(lián)［20］，也可作為防治腦卒中疾病的靶標(biāo)。

之前筆者以信息學(xué)方式，基于KEGG信號通路來預(yù)測信號通路與固有免疫途徑相關(guān)，KEGG信號通路能提供各個基因間的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而Biocarta信號通路著重于蛋白質(zhì)生物學(xué)通路，與KEGG不同，它以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為主要部分，能夠預(yù)測具體發(fā)揮作用者。Biocart信號通路映射后發(fā)現(xiàn)，其中Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［21］在固有免疫過程中起著重要作用，有文獻(xiàn)證實其與腦缺血再灌注的機(jī)制相關(guān)［22］。Toll樣受體蛋白、Nod樣受體、視黃酸誘導(dǎo)蛋白RIG-I樣受體以及C型凝集素受體共同組成了固有免疫的模式識別受體［23-24］，其防治感染性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病還可能與調(diào)節(jié)固有免疫識別途徑有關(guān)［25］。神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)節(jié)突觸生長［26］，保護(hù)血管平滑肌［27］。其余細(xì)胞凋亡、MAPK信號通路［28］與腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)及抑制炎癥指標(biāo)相關(guān)，可控制炎癥進(jìn)程，防止其因子對腦缺血再灌注進(jìn)行損害。靶細(xì)胞結(jié)合HPLC-TOF MS法可以為含有復(fù)雜成分的中藥復(fù)方與靶細(xì)胞的相互作用提供有效成分，而生物信息學(xué)分析初步為揭示其防治疾病的分子機(jī)制提供方向，為進(jìn)一步實驗提供基礎(chǔ)，也為研究成分更為復(fù)雜的中藥復(fù)方作用機(jī)理提供思路方法和研究借鑒。

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Analysis of bioactive constituents in Danhong Injection by target cell extraction combined with HPLC-TOF MS

LV Yan-ni1， QIAN Yi-song2， FU Long-sheng1*

（1.The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 33OO46，China；2.Instituteof Translational Medicineof Nanchang University，Nanchang 33OO31，China）

AIM To analyze the bioactive constituents in Danhong Injection by target cell extraction and HPLC-TOF MS and predict its molecular mechanism of prevention and treatment of disease via bioinformatics. METHODS Microglia（BV2 cells）and Danhong Injection were incubated together，the obtained cell disruption sap was analyzed by HPLC-TOFMS.Then the proteins and signaling pathways related to stroke weremined in the constituents combined with target cells.RESULTS Five water-soluble constituents（danshensu，protocatechuic aldehyde，6-hydroxysafflor yellow A，rosmarinic acid and salvianolic acid B）in Danhong Injection were extracted from the BV2 cell disruption sap.The constituents combined with target cells-protein network were then constructed and mapped onto Biocart pathways（Toll-like receptor signaling pathway，neurotrophic factor，apoptosis，MAPK signaling pathways，etc.），which were associated with inflammation and oxidative stress in the mechanism of stroke.CONCLUSION This research preliminarily demonstrates the relationship between Danhong Injection and signaling pathways related with stroke.

Danhong Injection；bioactive constituents；BV2 cells；stroke；HPLC-TOFMS；bioinformatics

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2691-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.026

2015-02-10

呂燕妮（1986—），女，博士生，研究方向為臨床藥理學(xué)和信息學(xué)。E-mail：lvyanni@126.com

*通信作者：付龍生，男，臨床藥師。E-mail：305260242@qq.com