白細(xì)胞介素-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活、凋亡的影響及機(jī)制

謝啟應(yīng)，楊天倫，孫澤琳，易軍

白細(xì)胞介素-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活、凋亡的影響及機(jī)制

謝啟應(yīng)，楊天倫，孫澤琳，易軍

目的：通過氯化鈷構(gòu)建缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型，探討白細(xì)胞介素-8（IL-8）對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活、凋亡的影響及機(jī)制。

方法：體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入不同濃度氯化鈷或IL-8 孵育，檢測(cè)細(xì)胞存活率。正?；蛉毖鮾?nèi)皮細(xì)胞加入IL-8或同時(shí)加入IL-8抗體/蛋白激酶B（Akt）抑制劑LY294002孵育48 h，采用四唑鹽比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率；用流式細(xì)胞術(shù)連接素V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/ PI）雙染標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；蛋白免疫印跡法檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、磷酸化Akt（pAkt）和磷酸化糖原合成酶激酶3βser9（pGSK-3βser9）蛋白表達(dá)。

結(jié)果：低濃度氯化鈷（50，100 μmol/L）孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVECs） 12 h可促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.01）；而高濃度氯化鈷（200，400 μmol/L）孵育24 h和48 h則均明顯減少內(nèi)皮細(xì)胞存活。10、50和100 ng/ml的IL-8分別孵育內(nèi)皮細(xì)胞48 h和72 h均可明顯改善缺氧對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響，細(xì)胞存活增加（P＜0.01）。10 ng/ ml的IL-8可顯著抑制正常和缺氧細(xì)胞的凋亡和下調(diào)caspase-3水平，上調(diào)pAkt和pGSK-3βser9水平（P＜0.01）；而LY294002或IL-8抗體均可拮抗IL-8的上述作用（P＜0.01）。

結(jié)論：IL-8可通過下調(diào)caspase-3水平，上調(diào)pAkt和pGSK-3βser9水平，從而抑制缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活。

白細(xì)胞介素8；內(nèi)皮細(xì)胞；蛋白激酶類

Objective: To investigate the effect of interleukin-8 (IL-8) on survival and apoptosis of hypoxic human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with its mechanisms.

Methods: Hypoxic HUVECs were induced by CoCl2. HUVECs were cultured with different concentrations of CoCl2or IL-8 and the survival rates of HUVECs were examined. Normal or hypoxic HUVECs were incubated with IL-8 or simultaneously incubated with anti-IL-8 or Akt inhibitor LY294002 for 48h. The HUVECs survival rate was detected by MTT method, apoptosis rate was measured by Annexin V-FITC/PI method, the protein expressions of Caspase-3, phosphorylated Akt (pAkt) and GSK-3βser9(pGSK-3βser9) were evaluated by Western blot analysis.

Results: By 12 h incubation with low concentration of CoCl2(50, 100 μmol/L), HUVECs proliferation were improved, P＜0.01; while by 24h and 48 h incubation with high concentration of CoCl2(200, 400 μmol/L) HUVECs survival were decreased. By 48h and 72h incubation with IL-8 at (10, 50, 100 ng/ml), the hypoxia induced cell apoptosis was decreased and the survival was increased, P＜0.01. IL-8 at 10 ng/ml may obviously inhibit the normal and hypoxic HUVECs apoptosis, down-regulate caspase-3 and up-regulate pAkt and pGSK-3βser9expressions in HUVECs, P＜0.01, while the above effects could be reversed by LY294002 and anti-IL-8, P＜0.01.

Conclusion: IL-8 could down-regulate caspase-3 and up-regulate pAkt and pGSK-3βser9expressions in HUVECs and therefore, inhibit the apoptosis and improve the survival of hypoxic HUVECs.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1216.)

治療性血管新生是冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄時(shí)一種重要的代償機(jī)制，有助于改善心肌供血，有多種炎癥因子、細(xì)胞啟動(dòng)和參與該過程[1]。白細(xì)胞介素-8（IL-8）屬于CXC 趨化因子亞家族，是激活和趨化炎性細(xì)胞的主要趨化因子之一，不僅是一種重要的炎癥因子，而且可促進(jìn)多種腫瘤組織的血管新生[2,3]。既往我們發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血清IL-8水平顯著增加，且與冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)分級(jí)與評(píng)分相關(guān)[4]。內(nèi)皮細(xì)胞是機(jī)體最先感受缺氧的細(xì)胞之一，在血管新生中起重要作用。IL-8可直接誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移和血管新生[3,5]。IL-8與受體結(jié)合后以磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）依賴的方式激活蛋白激酶B（PKB即Akt）[6]。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是Akt下游因子之一[7]。PI3K/Akt/GSK-3β/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）途徑在調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡中起重要作用。缺氧孵育的內(nèi)皮細(xì)胞更符合冠心病患者心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞功能變化，缺氧可通過激活I(lǐng)L-8信號(hào)途徑促進(jìn)血管新生[8]。但I(xiàn)L-8對(duì)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過氯化鈷構(gòu)建缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型，探討IL-8對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，及與caspase-3、磷酸化Akt（pAkt)和磷酸化GSK-3βser9（pGSK-3βser9）表達(dá)的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVECs）購于湖南長(zhǎng)沙遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司（細(xì)胞來源于美國ATCC細(xì)胞庫，貨號(hào)CRL-2873）。連接素V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/ PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國ADL公司；LY294002購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；氯化鈷購自湖南長(zhǎng)沙遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司；重組人IL-8購自上海希美生物科技有限公司；四唑鹽（MTT）、四甲基乙二胺（TEMED）購自美國Sigma公司；總蛋白提取試劑盒、鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國ProMab公司；兔pAKT抗體、鼠caspase-3抗體購自美國Santa Cruz公司；兔pGSK-3β抗體購自美國Milipore公司；羊抗鼠IgG+A+M(H+L)/HRP購自美國ZYMED公司。BD FACSAria流式細(xì)胞分選儀系美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)方法

（1）正常培養(yǎng)：細(xì)胞株復(fù)蘇成功后，培養(yǎng)瓶中加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下6孔板中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)，至細(xì)胞生長(zhǎng)融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板（1×109/L），無小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分組進(jìn)行下一步試驗(yàn)。（2）缺氧培養(yǎng)：正常培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，培養(yǎng)液中加入終濃度為200 μmol/L 的氯化鈷，培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)為缺氧模型。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組

不同濃度氯化鈷誘導(dǎo)缺氧對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率/增殖的影響： 氯化鈷可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的表達(dá)，但對(duì)IL-8的表達(dá)無影響，故按文獻(xiàn)方法采用氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧模型[9,10]。收集對(duì)數(shù)期的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1×104個(gè)/孔將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；培養(yǎng)24 h后分別加入終濃度為0、50、100、200和400 μmol/L的氯化鈷，分別培養(yǎng)12、24和48 h。采用四唑鹽比色法分析細(xì)胞存活率。共15組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

不同濃度IL-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率/增殖的影響：收集對(duì)數(shù)期缺氧培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0、1、10、50、100 ng/ml的重組人IL-8；對(duì)照組為普通正常培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；分別培養(yǎng)24、48、72 h。采用四唑鹽比色法分析細(xì)胞存活率。共18組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

IL-8對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及caspase-3、pAkt和pGSK-3βser9水平的影響：分為八組：（1）對(duì)照組：未添加IL-8和氯化鈷正常培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；（2）缺氧組：培養(yǎng)液中加入終濃度為200 μmol/L的氯化鈷；（3）IL-8組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/ml的IL-8；（4）IL-8+缺氧組：缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/ml的IL-8；（5）Anti-IL-8組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/ml的IL-8和10 μg/ml的Anti-IL-8；（6）Anti-IL-8+缺氧組：缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/ml的IL-8和10 μg/ml 的Anti-IL-8；（7）LY294002組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/ml的IL-8和20 μmol/L的Akt抑制劑LY2904002；（8）LY294002+缺氧組：缺氧培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/ml的IL-8和20 μmol/L的LY294002。各組培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞采用Annexin V-FITC/ PI雙染標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，蛋白免疫印跡法檢測(cè)pAkt、pGSK-3βser9和caspase-3的水平。

1.4四唑鹽比色法

按文獻(xiàn)方法檢測(cè)細(xì)胞存活率[11]。孵育結(jié)束后每孔加入50 μl 1×四唑鹽，37℃孵育4 h；棄除培養(yǎng)液后加入二甲基亞砜（DMSO）150 μl，低速振蕩10 min。在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值。細(xì)胞存活率計(jì)算：將各測(cè)試孔的OD值減去本底OD值（培養(yǎng)基加四唑鹽，無細(xì)胞）。細(xì)胞的存活率以T/ C%表示，T為測(cè)試細(xì)胞的OD值，C為對(duì)照細(xì)胞的OD值。細(xì)胞存活率（%）=（測(cè)試細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100%。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按照參考文獻(xiàn)[11]方法采用Annexin V-FITC/ PI雙染標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞以預(yù)冷1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，500 r/min離心10 min。加入標(biāo)記液（每100 μl含10×binding buffer 10 μl，annexin V-FITC 5 μl，distilled water 85 μl），按照105～106細(xì)胞/100 μl，室溫避光孵育15 min，加入50 mg/ml的PI 10 μl，后加入400 μl×binding buffer稀釋，15 min內(nèi)用BD FACSAria流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。用CELL Quest軟件對(duì)結(jié)果散點(diǎn)圖進(jìn)行分析。

1.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白

按試劑盒說明操作。收集細(xì)胞后1×PBS 洗滌1次。加入總蛋白提取液吹打至細(xì)胞完全破碎，10 000 r/min離心10 min。采用分離膠為12%的SDSPAGE恒壓200 V電泳，用“三明治電轉(zhuǎn)法”恒流300 mA，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用含5%脫脂奶粉PBS封閉膜2 h。分別加入兔pAKT多抗（1:400）,兔pGSK-3βser9多抗（1:400）, 小鼠caspase-3多抗（1:400），小鼠GAPDH抗體（1:1 000），室溫下孵育2 h。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔-HRP 1:50 000或羊抗鼠-HRP 1:50 000～1:40 000），室溫下孵育1 h，滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物，暗室中采用柯達(dá)膠片記錄熒光信號(hào)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1不同濃度氯化鈷誘導(dǎo)缺氧對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響（圖1）

圖1　四唑鹽方法分析不同濃度氯化鈷誘導(dǎo)缺氧對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響（n=6）

不同濃度氯化鈷孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 12 h，低濃度氯化鈷（50，100 μmol/L）有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用（P＜0.01），而高濃度氯化鈷(200，400 μmol/L)無明顯作用；孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 24 h后僅50 μmol/L 氯化鈷有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用（P＜0.01），而高濃度氯化鈷（200，400 μmol/L）表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞存活減少（P＜0.01）；孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 48 h后低濃度氯化鈷（50，100 μmol/L）對(duì)細(xì)胞存活的作用不明顯，高濃度氯化鈷（200，400 μmol/L）孵育后細(xì)胞數(shù)目減少，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率明顯減少（P＜0.01）。

2.2不同濃度IL-8對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響（圖2）

不同濃度IL-8（1、10、50、100 ng/ml）孵育缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 24 h，有改善缺氧所致細(xì)胞死亡趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。孵育缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 48 h和72 h后，1 ng/ml的IL-8有改善缺氧所致細(xì)胞死亡趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而10、50和100 ng/ml的IL-8均可明顯改善缺氧所致的細(xì)胞死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞存活率增多（P＜0.01）。

2.3IL-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

用軟件分析流式細(xì)胞檢測(cè)的各組凋亡分別為：對(duì)照組2.36±0.08、缺氧組13.56±0.65、IL-8組1.96±0.09、IL-8+缺氧組9.17±0.32、Anti-IL-8組2.38±0.08、Anti-IL-8+缺氧組13.53±0.57、LY294002組3.26±0.08和LY294002+缺氧組15.13±0.37。如圖3所示，IL-8可抑制正常孵育細(xì)胞的凋亡（1.96±0.09 vs 2.36±0.08，P＜0.05），而IL-8抗體和Akt抑制劑LY294002均可拮抗該作用。缺氧顯著增加細(xì)胞的凋亡（13.56±0.65 vs 2.36±0.08，P＜0.01），IL-8可明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（9.17±0.32 vs 13.56±0.65，P＜0.01），而IL-8抗體或LY294002均明顯拮抗IL-8抑制缺氧細(xì)胞凋亡的作用（13.53±0.57 vs 9.17±0.32，15.13±0.37 vs 9.17±0.32，P＜0.01）。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2　四唑鹽方法分析不同濃度IL-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響（n=6）

圖3　IL-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響（n=6）

2.4IL-8對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3、pAkt和pGSK-3βser9水平的影響（圖4）

與對(duì)照組比較，缺氧組caspase-3水平增加（308.35±5.60 vs 80.50±3.12，P＜0.01）；pAkt和pGSK-3βser9水平明顯下降（143.40±6.22 vs 322.68±6.11，97.42±4.28 vs 223.68±7.05，P均＜0.01）。分別與對(duì)照組和缺氧組比較，IL-8均可明顯下調(diào)caspase-3（63.8±4.26 vs 80.50±3.12， P＜0.05；63.8±4.26 vs 308.35±5.60，P＜0.01）水平；上調(diào)pAkt（376.50±4.09 vs 322.68±6.11，P＜0.05；376.50±4.09 vs 143.40±6.22，P＜0.01）水平和pGSK-3βser9（281.13±9.79 vs 223.68±7.05，P＜0.05；281.13±9.79 vs 97.42±4.28，P＜0.01）水平；而LY294002或IL-8抗體均可拮抗IL-8的上述作用（P＜0.01）。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4　蛋白免疫印跡法分析IL-8對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3、pAkt和pGSK-3βser9水平的影響（n=3）

3　討論

內(nèi)皮細(xì)胞是血液與組織之間的第一道屏障，具有多種生理功能，是最先感受缺氧的細(xì)胞之一。生長(zhǎng)因子通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及黏附和抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡兩個(gè)方面來促進(jìn)血管生成。制備內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型有物理和化學(xué)方法，研究發(fā)現(xiàn)利用氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型具有劑量可準(zhǔn)確控制、無特殊設(shè)備要求等優(yōu)點(diǎn)[10]。本研究顯示：低濃度氯化鈷(50、100 μmol/L) 孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞12 h有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。而高濃度氯化鈷（200、400 μmol/L）孵育24 h后明顯抑制細(xì)胞增殖，顯示缺氧效應(yīng)，是一種理想的缺氧模型誘導(dǎo)劑。低氧能刺激多種炎癥和生長(zhǎng)因子的表達(dá), 促進(jìn)血管新生。慢性缺氧削弱心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的耐受性，而恢復(fù)供氧通過激活A(yù)kt和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2（ERK1/2）信號(hào)途徑保護(hù)心肌[12]。白細(xì)胞介素是主要的炎癥因子之一，可介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)等參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展[13]。IL-8是白細(xì)胞介素家族中一種多能細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)。既往我們發(fā)現(xiàn)，IL-8與CXCR2受體結(jié)合通過活性氧—核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB/活化蛋白-1（ROS-NF-кB/AP-1）信號(hào)通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化、黏附到內(nèi)皮細(xì)胞[14]。此外，IL-8能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤組織增殖、遷移和毛細(xì)血管形成[3,15]。研究顯示，IL-8與發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[16]。冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄的冠心病患者血清IL-8水平顯著增加，且與冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)分級(jí)與評(píng)分相關(guān)[4]，推測(cè)IL-8表達(dá)增加與心肌缺氧誘導(dǎo)的血管新生有關(guān)系。本研究顯示：10、50和100 ng/ml的IL-8孵育48 h后均可明顯改善氯化鈷誘導(dǎo)缺氧所致臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，呈劑量依賴性促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

IL-8受體包括CXCR1, CXCR2和Duffy。IL-8與其受體結(jié)合后激活下游分子通路。研究發(fā)現(xiàn)，IL-8可通過p38絲裂原活化蛋白激酶—核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB （p38MAPK-NF-кB）途徑誘導(dǎo)血管新生[17]，也可與CXC受體結(jié)合后激活PI3K/Akt誘導(dǎo)細(xì)胞遷移[6]。在缺血再灌注損傷中目前已知有三條保護(hù)心肌的信號(hào)通路，在早期主要是通過PI3K/ Akt/ROS/NO/PKC/p38 MAPK和PI3K / ERK1/2 信號(hào)途徑[18]。PI3K/Akt通路是介導(dǎo)細(xì)胞存活的經(jīng)典通路之一，Akt是PI3K下游主要的效應(yīng)物。活化的Akt通過磷酸化作用可引起鈣動(dòng)員和（或）MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，或激活GSK-3β、Bax和核因子-кB（NF-кB）等下游靶蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。LY294002是Akt拮抗劑，可通過阻斷Akt的磷酸化抑制細(xì)胞增殖和腫瘤誘發(fā)的血管生成[19]。GSK-3β是Akt重要的下游因子之一，它存在兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)，在其N端絲氨酸9（ser9）處的磷酸化可明顯降低GSK-3β的活性，而酪氨酸216（Tyr216）的磷酸化則可增強(qiáng)它的活性。GSK-3β活性增加激活細(xì)胞凋亡的多種蛋白激酶如Bax、caspases家族等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6,20]。caspase的活化是凋亡發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中主要的終末剪切酶，反映了凋亡啟動(dòng)以及細(xì)胞的凋亡水平。在缺血性心肌損傷模型中，caspase-3激活同時(shí)伴有GSK-3β的激活，而GSK-3β激活可以進(jìn)一步促進(jìn)caspase-3的激活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)：同對(duì)照組相比，缺氧的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Akt和GSK-3βser9明顯降低，caspase-3明顯升高，細(xì)胞凋亡增加。而不論有無缺氧，IL-8孵育均促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Akt和GSK-3βser9的表達(dá)，降低Caspase-3表達(dá)和細(xì)胞凋亡；同時(shí)予以IL-8抗體或Akt抑制劑LY294002則可拮抗該作用。提示IL-8可通過與其受體結(jié)合后經(jīng)磷酸化Akt/ GSK-3βser9途徑影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，本研究提示IL-8與受體結(jié)合后經(jīng)激活PI3K/Akt/GSK-3βser9途徑，降低GSK-3β活性，減少caspase-3的表達(dá)，從而減少氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖。

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（編輯：漆利萍）

Effect and Mechanism of Interleukin-8 on Survival and Apoptosis of Hypoxic Human Umbilical Vein Endothelial Cells

XIE Qi-ying, YANG Tian-lun, SUN Ze-lin, YI Jun.
Department of Cardiology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha (410008), Hunan, China
Corresponding Author: YI Jun, Email: yjwx0312@163.com

Interleukin-8; Endothelial cell; Akt; Protein kinase

湖南省科技廳科研基金資助（2008FJ4183）

410008 湖南省長(zhǎng)沙市，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 心內(nèi)科

謝啟應(yīng) 副教授 博士 主要從事冠心病防治及心臟起搏電生理 Email: eagledoctor@163.com 通訊作者：易軍 Email: yjwx0312@163.com

R54

A

1000-3614（2015）12-1216-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.12.020

2015-03-31)