快速寬場(chǎng)顯微光切片成像技術(shù)分析及研究進(jìn)展

張剛平+李毅彩+何春蘭

摘要：本文描述了目前流行的幾種基于寬場(chǎng)顯微鏡的快速光切片成像技術(shù)和裝置，包含非干涉測(cè)量的寬場(chǎng)光切片技術(shù)、基于變形光柵的實(shí)時(shí)三維成像寬場(chǎng)顯微切片技術(shù)、基于微條紋陣列LED的顯微光切片技術(shù)、基于變焦透鏡的寬場(chǎng)顯微光切片技術(shù)。通過(guò)對(duì)這幾種技術(shù)的分析，找到他們的優(yōu)缺點(diǎn)，充分發(fā)揮技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用范圍，同時(shí)也對(duì)這些技術(shù)提出了更高的要求。對(duì)寬場(chǎng)顯微鏡的改造可更大限度的發(fā)揮它的優(yōu)勢(shì)，使其能廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像及相關(guān)領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：衍射光柵;變形光柵;變焦透鏡

中圖分類號(hào)：G642.0 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? 文章編號(hào)：1674-9324（2015）45-0076-02

伴隨光學(xué)顯微鏡技術(shù)的飛速發(fā)展，顯微技術(shù)也在相應(yīng)的不斷進(jìn)步。經(jīng)過(guò)有關(guān)光學(xué)系統(tǒng)及信息處理能夠使顯微鏡的分辨率大幅提高，用于生物樣品三維信息的獲取、記錄、處理和顯示的顯微鏡成像系統(tǒng)也得到了很大發(fā)展。在顯微鏡成像過(guò)程中，其所獲取的每一幅圖像都包含了焦平面和焦平面外的光信息，焦平面外的信息對(duì)所成圖像造成了很大的模糊干擾，因而使得圖像清晰度降低甚至無(wú)法識(shí)別。為了去除這些離焦光信息，人們嘗試了許多解決辦法。激光掃描共焦技術(shù)在熒光顯微成像的基礎(chǔ)上克服了離焦平面信息的干擾，從而得到了清晰地聚焦平面的圖像。但是其缺點(diǎn)也是很顯然的：其價(jià)格昂貴不利于技術(shù)的普及;不能得到樣品完整、真彩的圖像;由于需作二維逐點(diǎn)掃描，其成像速度受到限制，不能對(duì)樣品實(shí)施快速動(dòng)態(tài)成像。寬場(chǎng)顯微鏡是一套傳統(tǒng)的顯微鏡，其價(jià)格便宜，可廣泛用于各種行業(yè)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速觀測(cè)，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的三維觀察，首先需要對(duì)樣品進(jìn)行光學(xué)切片，在基于寬場(chǎng)顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)對(duì)顯微鏡的改進(jìn)，可采用各種方法實(shí)現(xiàn)寬場(chǎng)顯微鏡的光學(xué)切片成像。隨著對(duì)微觀世界更深入的研究，人們希望進(jìn)一步提高光切片質(zhì)量和切片的速度等。本文將介紹幾種基于寬場(chǎng)顯微技術(shù)的快速三維成像技術(shù)。

一、非干測(cè)量的寬場(chǎng)光切片技術(shù)

細(xì)胞膜的活動(dòng)在細(xì)胞的力學(xué)中扮演著重要的角色，因此觀測(cè)細(xì)胞膜的三維結(jié)構(gòu)是非常重要的。一般我們使用相襯和熒光顯微鏡技術(shù)去觀察它的活動(dòng)，然而這種光學(xué)觀察只能提供細(xì)胞邊界的信息，很難去了解細(xì)胞表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。為了清楚實(shí)時(shí)地觀察到生物樣品的三維結(jié)構(gòu)，這種儀器應(yīng)該滿足分辨率高、成像速度快、視野大等多種要求。在基于寬場(chǎng)顯微光切片的技術(shù)基礎(chǔ)上，可以采用一種新的光學(xué)技術(shù)——非干涉測(cè)量的寬場(chǎng)顯微鏡光學(xué)輪廓測(cè)量技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)這一要求。這一技術(shù)不需后期的掃描機(jī)制即可得到三維圖像，系統(tǒng)中探針是浸入水的物鏡，它的工作距離在毫米范圍內(nèi)。圖1顯示的是實(shí)驗(yàn)裝置，該裝置采用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡作為主要的設(shè)備，使用一個(gè)功率固定的鎢鹵素?zé)糇鳛楣庠?，它的功率波?dòng)范圍為小于1%，帶通濾波片的波長(zhǎng)范圍為350～610納米。這套系統(tǒng)使用柵格圖案在空間相位0，2π/3，4π/3獲得三幅圖像，然后使用零查探測(cè)原理去刪除這個(gè)柵格圖案獲得光學(xué)剖面圖像，通過(guò)對(duì)圖像的后期處理即可呈現(xiàn)樣品的3D結(jié)構(gòu)。

二、基于Z軸自動(dòng)控制寬場(chǎng)光切片技術(shù)

在對(duì)細(xì)胞或者微小的樣品進(jìn)行觀察時(shí)，顯微鏡是必不可少的工具，但是一般的顯微鏡包括寬場(chǎng)顯微鏡只能觀察他們的二維圖像，為了得到三維的圖像，需要在顯微鏡的z軸方向上進(jìn)行光學(xué)切片，得到不同焦平面的圖像，然后利用計(jì)算機(jī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)三維重構(gòu)。為了在寬場(chǎng)顯微鏡中得到Z軸上不同的焦平面信息，需要對(duì)軸進(jìn)行微調(diào)，Z軸方向每上升或者下降一定的距離獲取一副圖像。傳統(tǒng)的方法是用手動(dòng)的方式去調(diào)節(jié)Z軸的旋鈕，達(dá)到Z軸上升或下降的目的。這種方式使得得到的斷層掃描圖像難以獲得足夠的精度和足夠薄的切層厚度，而且各個(gè)斷層圖像的層厚變得不均勻，這樣將在很大程度上影響圖像的三維重構(gòu)效果，同時(shí)在進(jìn)行斷層掃面時(shí)圖像的拍攝時(shí)通過(guò)手動(dòng)的方式控制拍攝，這樣拍攝一副斷層圖像需時(shí)過(guò)長(zhǎng)，在熒光樣品拍攝前往往已經(jīng)暴露在激發(fā)光的強(qiáng)光之下，這樣大大增加了樣品被強(qiáng)光漂白導(dǎo)致?lián)p傷的危險(xiǎn)。因此，一種采用全自動(dòng)寬場(chǎng)顯微光切片的技術(shù)將具有重要意義。

這種技術(shù)能通過(guò)計(jì)算機(jī)控制顯微鏡物鏡Z軸作精確的微動(dòng)，來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行逐層掃描成像，其精度可達(dá)到納米級(jí)，同時(shí)它還能控制攝像系統(tǒng)對(duì)每層斷層圖像進(jìn)行自動(dòng)的攝取與存儲(chǔ)，不需人工干預(yù)。因此，在光路中加裝一套激發(fā)光快門(mén)開(kāi)合系統(tǒng)，通過(guò)計(jì)算機(jī)同步控制快門(mén)開(kāi)合系統(tǒng)和自動(dòng)數(shù)碼成像（或視頻圖像）拍攝系統(tǒng)，這些裝置的增加對(duì)寬場(chǎng)顯微光切片技術(shù)有著非常重要的意義。這樣的一套系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于各種醫(yī)學(xué)和生物研究領(lǐng)域，特別是需要觀察三維斷層的相關(guān)領(lǐng)域如生物醫(yī)學(xué)成像與生物醫(yī)學(xué)材料的領(lǐng)域，具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。

三、變形光柵光切片技術(shù)

要想得到物體不同層的圖像，傳統(tǒng)的方法是移動(dòng)透鏡或者相機(jī)，但是在一些應(yīng)用中物體或者成像條件是快速變化的，需要設(shè)備能在相同條件下同時(shí)捕獲多個(gè)層的圖像。其中一種方法是采用分束器，將一束光分成幾束，然后使用多個(gè)相機(jī)來(lái)獲得圖像，通過(guò)移動(dòng)相機(jī)來(lái)達(dá)到獲取不同焦平面圖像的目的。但是這種方法會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)并且需要多個(gè)同步相機(jī)。一種使用特別設(shè)計(jì)的變形光柵能被當(dāng)作分束器使用，在單圖像平面同時(shí)記錄多個(gè)物體不同焦平面的信息，這將只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的光學(xué)系統(tǒng)便可實(shí)現(xiàn)同時(shí)獲取不同層面的圖像，大大降低了成本。使用變形光柵同時(shí)得到多個(gè)物層面圖像的方法原理在于，變形光柵是一個(gè)二元位相光柵。其暗區(qū)域能增加光學(xué)厚度，它在非零衍射序列具有聚焦的功能。特別設(shè)計(jì)的光柵在每一個(gè)變形序列上具有不同焦長(zhǎng)的透鏡的作用，在圖像視野產(chǎn)生假的三維圖像。光柵焦長(zhǎng)和圖像面的分離是通過(guò)設(shè)計(jì)光柵結(jié)合物體放大倍數(shù)實(shí)現(xiàn)的。該技術(shù)的基礎(chǔ)是變形的衍射光柵，它的光柵線由一個(gè)半徑為二次方程的光柵線構(gòu)成。它產(chǎn)生的光柵線是圓弧并且它的中心是偏離透鏡軸中心的，如圖2所示，變形光柵扮演一套透鏡的功能，它能修改每一個(gè)衍射序列（+1，0，-1）的焦長(zhǎng)，這導(dǎo)致三個(gè)物面在同一個(gè)探測(cè)器面上呈現(xiàn)。當(dāng)光束進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)，零序列衍射產(chǎn)生一幅激光束焦斑圖像，+1和-1序列提供光束焦平面后和焦平面前兩個(gè)層面的圖像。因此，利用這種技術(shù)可在不需要任何掃描特別是縱向掃描，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品多層面同時(shí)一次成像。但是缺點(diǎn)是一次只能進(jìn)行三層成像，需要更多層數(shù)成像需要加裝Z軸掃描裝置。

四、基于變焦透鏡的寬場(chǎng)顯微光切片技術(shù)

這種技術(shù)原理類似于前面介紹的基于Z軸自動(dòng)控制寬場(chǎng)光切片技術(shù)，將Z軸的機(jī)械控制裝置用可變焦的透鏡來(lái)代替。通過(guò)改造寬場(chǎng)顯微鏡可實(shí)現(xiàn)這一功能，如圖4所示。在該設(shè)備中，需要自制一模塊，該模塊包含一些透鏡和可電控的變焦透鏡放置在靠近物鏡的地方和成像端口想連接，同時(shí)為了在目鏡中能觀察到清晰的圖像許在目鏡端口加裝一相同變焦透鏡。這一裝置進(jìn)行光學(xué)切片的原理相對(duì)比較簡(jiǎn)單，通過(guò)計(jì)算機(jī)或者其他裝置控制變焦透鏡的驅(qū)動(dòng)裝置，改變電流，透鏡的焦距會(huì)隨著電流大小發(fā)生變化，焦距變化后可得到樣品不同層的光學(xué)信息，完成光學(xué)切片的功能。通過(guò)實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)控制，可實(shí)現(xiàn)快速自動(dòng)寬場(chǎng)顯微鏡光學(xué)切片技術(shù)。另外為了讓顯微鏡的改造變得更加簡(jiǎn)單，可以在顯微鏡的成像接口處加裝一套帶有變焦透鏡的中繼成像裝置。這一技術(shù)在原理上并不復(fù)雜，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需要加裝機(jī)械掃描裝置，減少了使用機(jī)械裝置進(jìn)行掃描時(shí)帶來(lái)的震動(dòng)，同時(shí)通過(guò)精密電流控制可使得描層厚均勻，但是掃描需要時(shí)間比較長(zhǎng)，為實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速的掃描帶來(lái)了挑戰(zhàn)。

五、小結(jié)

上面介紹的快速寬場(chǎng)顯微鏡光切片技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，他們大多數(shù)需要對(duì)Z軸進(jìn)行掃描，不僅影響了掃描速度，而且使用高精密的控制設(shè)備成本也比較高，掃描層厚也不均勻，針對(duì)這些缺點(diǎn)，我們可以在寬場(chǎng)顯微鏡的基本框架結(jié)構(gòu)上，結(jié)合多種寬場(chǎng)光切片技術(shù)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)觀察樣品，另外發(fā)展一套新的快速實(shí)時(shí)寬場(chǎng)顯微光切片技術(shù)。例如在顯微鏡的成像接口處加裝一套變形光柵系統(tǒng)和變焦透鏡，可以在改變一次變焦的同時(shí)獲得三層切片圖像，可大大縮短切片的時(shí)間，降低樣品長(zhǎng)時(shí)間暴露在強(qiáng)光下導(dǎo)致的光損傷，它能快速的進(jìn)行實(shí)時(shí)光學(xué)切片。這樣的一個(gè)系統(tǒng)預(yù)期可廣泛應(yīng)用于各種需要進(jìn)行實(shí)時(shí)三維斷層觀測(cè)的領(lǐng)域如生物醫(yī)學(xué)，生物材料等領(lǐng)域，具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。

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