大豆錳超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)

馬紅丹，張麗媛，趙邯鄲，徐丹丹，曲 靜，關(guān)淑艷,*，王丕武,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118）

大豆錳超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)

馬紅丹1，張麗媛1，趙邯鄲1，徐丹丹1，曲 靜2，關(guān)淑艷1,*，王丕武2,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118）

為使大豆錳超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase，MnSOD）在乳酸乳球菌中高效表達(dá)，將克隆的MnSOD基因開放閱讀框序列分別重組到質(zhì)粒pNZ8149和經(jīng)改造的質(zhì)粒pNZS上，表達(dá)載體pNZ-SOD和分泌表達(dá)載體pNZS-SOD，將兩者分別以電穿孔法轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌L. lactis NZ3900，經(jīng)Elliker瓊脂板篩選、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、酶切鑒定正確后，獲得的兩重組菌株加入Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對L. lactis NZ3900/pNZ-SOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和酶活性對比分析。結(jié)果顯示：L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD菌株表達(dá)SOD總活性約是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍，是L. lactis NZ3900/pNZ8149的13.5倍，且可將表達(dá)的約2/3的SOD分泌到胞外，表明經(jīng)改造的乳酸菌分泌表達(dá)系統(tǒng)L. lactis NZ3900/pNZS能夠分泌表達(dá)SOD，并增強(qiáng)SOD的表達(dá)。

錳超氧化物歧化酶（MnSOD）；食品級分泌表達(dá)載體；乳酸乳球菌

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物體防御氧化損傷的重要酶類，對生物體生命活動具有重要意義。錳超氧化物歧化酶（MnSOD）是SOD的一種，已有研究表明MnSOD基因過量表達(dá)與多種腫瘤（如乳腺癌、肺癌、胃癌等）相關(guān)，被認(rèn)為是一種新的抗癌基因，因而受到廣泛關(guān)注[1-4]。但MnSOD在生物體內(nèi)表達(dá)量較低，獲取困難，而應(yīng)用重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)可解決這一難題。目前，多種來源的MnSOD基因已在不同微生物中成功克隆和表達(dá)[5-7]。

乳酸菌是公認(rèn)的食品級安全微生物，在食品工業(yè)和生物制藥等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在基因工程領(lǐng)域，已建立一系列基于乳酸菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，應(yīng)用這些系統(tǒng)定向生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品將成為熱點。乳酸菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中應(yīng)用較多的是NICE系統(tǒng)，L. lactis NZ3900/ pNZ8149是NICE系統(tǒng)中的一種，其誘導(dǎo)劑、篩選標(biāo)記和宿主均為食品級，符合美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）安全標(biāo)準(zhǔn)，是食品級安全的外源基因表達(dá)系統(tǒng)[8]，已有來源于動物、植物、微生物的不同外源基因在該系統(tǒng)中成功表達(dá)[9-11]。但外源基因在該系統(tǒng)中為胞內(nèi)表達(dá)，可能存在外源基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)積累容易形成包涵體、產(chǎn)物容易被細(xì)胞內(nèi)水解酶系統(tǒng)識別作為異源入侵物水解、獲得目的蛋白需要對菌體進(jìn)行破碎處理等缺點，因此該系統(tǒng)在實際應(yīng)用中具有一定局限性。

本實驗室已利用基因工程技術(shù)，對質(zhì)粒pNZ8149進(jìn)行改造，在其啟動子PnisA后插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白Usp45胞外分泌信號肽基因序列SPusp45，并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)定點刪除啟動子與信號肽之間的酶切位點，獲得分泌表達(dá)載體pNZS，重新建立分泌表達(dá)系統(tǒng)L. lactis NZ3900/pNZS[12]，以打破該系統(tǒng)局限性。本實驗分別將大豆MnSOD基因?qū)隠. lactis NZ3900/pNZ8149和L. lactis NZ3900/pNZS系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，嘗試對兩系統(tǒng)表達(dá)MnSOD基因的表達(dá)量和表達(dá)方式進(jìn)行對比分析，為MnSOD的高效表達(dá)和直接應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒和菌種

L. lactis NZ3900和配套載體pNZ8149 荷蘭NIZO研究所；大腸桿菌DH5α和質(zhì)粒pREP5N-MnSOD、經(jīng)改造質(zhì)粒pNZS 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心[12]；克隆用質(zhì)粒pMD18-T 大連寶生物公司。

1.1.2 引物

上游引物1：5′-GG ACT AGT ATG GCC GCG CGA GCT CTG T-3′；下游引物2：5′-TGC TCT AGA CTA AGA GCT CTC TTT CTC ATA C-3′；以下劃線標(biāo)記的序列為引入的限制性酶切位點（SpeⅠ、XbaⅠ），引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.1.3 試劑

pMD18-T克隆載體、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶及DL2000Mark0er 日本TaKaRa公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（116、66.2、45、35、25、18.4、14.4 kD） 加拿大MBI公司；Nisin標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UNO PCR儀 德國Biometra公司；DYY-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（配有DYY-33A型水平電泳槽、DYCZ-21型垂直電泳槽） 北京六一儀器廠；MicroPulserTM型電擊儀、Universal Hood S.N. 75s/01700凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的大豆MnSOD基因（序列號AJ440726）的開放閱讀框序列及pNZ8149和pNZS載體序列，應(yīng)用Premier5.0軟件設(shè)計一對特異性引物，并分別在上游引物和下游引物5′端引入限制性酶切位點SpeⅠ、XbaⅠ，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3.2 MnSOD基因的克隆與鑒定

以含有MnSOD基因全序列的pREP5N-MnSOD為模板，以引物1、2擴(kuò)增MnSOD開放閱讀框序列，產(chǎn)物以凝膠DNA回收試劑盒回收后，克隆到pMD18-T上，CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，試劑盒提質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗證，SpeⅠ、XbaⅠ雙酶切驗證，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.3.3 食品級載體的構(gòu)建及乳酸菌轉(zhuǎn)化

測序正確的轉(zhuǎn)化子，試劑盒提質(zhì)粒，以SpeⅠ、XbaⅠ雙酶切，凝膠回收目的片段后分別與同樣經(jīng)雙酶切回收的pNZ8149和pNZS質(zhì)粒以T4連接酶連接12 h，連接產(chǎn)物以電穿孔法轉(zhuǎn)化L. lactis NZ3900感受態(tài)細(xì)胞[13]，Elliker瓊脂板篩選陽性菌落[14]。挑取陽性菌落提質(zhì)粒進(jìn)行PCR及SpeⅠ，XbaⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確的兩重組質(zhì)粒送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，測序正確的表達(dá)載體命名為pNZ-SOD，分泌表達(dá)載體命名為pNZS-SOD。

1.3.4 SOD的誘導(dǎo)表達(dá)和乳酸乳球菌上清和菌體蛋白樣品的制備

L. lactis NZ3900/pNZ8149、L. lactis NZ3900/pNZSOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD分別接種于5 mL GM17的液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃過夜，次日以1%接種量接入新鮮培養(yǎng)基，至OD600nm在0.4～0.5之間，加入質(zhì)量濃度為5 ng/mL的Nisin誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，4 ℃離心分別收集上清和菌體，上清于－20 ℃冷凍12 h，4 ℃解凍、離心，收集沉淀，－20 ℃?zhèn)溆茫痪w用0.1 倍原培養(yǎng)體積磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）重懸，加溶菌酶37 ℃，0.5 h后用超聲波細(xì)胞破壁儀破壁，4 ℃離心收集上清液，即為菌體蛋白，－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

分別取上清樣品（0.1 倍原上清體積的PBS溶解）和菌體樣品16 μL與4 μL蛋白上樣緩沖液（5×）混合，95 ℃變性8 min后，4 ℃離心，取16 μL上清液上樣，進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮蘭染色后，觀察SOD特異條帶并掃描保存。

1.3.6 表達(dá)產(chǎn)物的酶活性檢測

以氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitroblue tetrazolium，NBT）光照還原法[15]分別測定新鮮制備的上清和菌體樣品SOD活性。3 mL反應(yīng)體系在光照結(jié)束后迅速以722分光光度計在560 nm波長處測定吸光度，每個樣品設(shè)5 個重復(fù)，取5 次測定的平均值，以抑制NBT光化還原反應(yīng)速率的50%所需的酶量為一個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 MnSOD基因開放閱讀框序列的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增MnSOD基因開放閱讀框序列，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外燈下觀察，有與目的基因大小相符的條帶，大小為726 bp左右，目的片段成功擴(kuò)增。

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-MnSOD的構(gòu)建及鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收克隆到pMD18-T載體上。經(jīng)藍(lán)白斑篩選得陽性菌株，提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒PCR及雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到與期望大小相一致的726 bp條帶（圖1），說明外源基因成功插入pMD18-T載體。將含有重組質(zhì)粒pMD18-TMnSOD的菌體送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。測序結(jié)果表明克隆到T載體上的MnSOD基因序列與GenBank中檢索到的大豆MnSOD序列一致，成功克隆目的基因。

圖1 T/MnSOD的鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid T/MnSOD

2.3 重組質(zhì)粒pNZ-SOD、pNZS-SOD的構(gòu)建及鑒定

質(zhì)粒pMD18-T-MnSOD經(jīng)SpeⅠ、XbaⅠ雙酶切、凝膠回收后獲得線性目的基因與同樣經(jīng)雙酶切、凝膠回收的線性質(zhì)粒pNZ8149、pNZS以T4連接酶連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pNZ-SOD和pNZS-SOD，重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化L. lactis NZ3900，經(jīng)Elliker瓊脂板篩選，均得到多個轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化成功。轉(zhuǎn)化子搖菌、提質(zhì)粒后，PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳后均得到與預(yù)期大?。?26 bp）相一致的片段，重組質(zhì)粒送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒所攜帶的目的基因與MnSOD基因序列一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并成功導(dǎo)入L. lact is NZ3900（圖2～4）。

圖2 重組質(zhì)粒pNZ-SOD和pNZS-SOD的構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematic representation of the organization of recombinant plasmids pNZ-SOD and pNZS-SOD

圖3 重組質(zhì)粒pNZ-SOD、pNZS-SOD的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of recombinant plasmids pNZ-SOD and pNZS-SOD

圖4 重組質(zhì)粒pNZ-SOD、pNZS-SOD的限制性酶切產(chǎn)物Fig.4 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmids pNZ-SOD and pNZS-SOD

2.4 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

L. lactis NZ3900/pNZ8149、L. lactisNZ3900/pNZSOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD經(jīng)Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后提取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，與L. lactis NZ3900/ pNZ8149和L. lactis NZ3900/pNZ-SOD相比，L. lactis NZ3900/pNZS-SOD上清樣品在約26 kD處多出一條明顯的特異性譜帶；而兩重組菌株菌體蛋白樣品比L. lactis NZ3900/pNZ8149均多出一條約26 kD大小的特異性譜帶，并且L. lactis NZ3900/pNZ-SOD株譜帶較L. lactis NZ3900/pNZS-SOD株譜帶深（圖5），這表明經(jīng)改造的乳酸菌分泌表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)⑼庠吹哪康牡鞍追置诘桨?，且表達(dá)量明顯高于L. lactis NZ3900/pNZ8149胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)。

圖5 重組質(zhì)粒pNZ-SOD、pNZS-SOD在L. lactisNZ3900中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of pNZ-SOD, pNZS-SOD expression in L. lactisNZ3900

2.5 SOD活性檢測

經(jīng)Nisin誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h后，提取SOD粗酶液，以BeauchamP建立的NBT還原法分別測定重組質(zhì)粒表達(dá)的SOD活性（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD表達(dá)SOD總活性和L. lactis NZ3900/pNZSOD、L. lactis NZ3900/pNZ8149菌株相比，均有極顯著（P＜0.01）提高；3 組上清樣品中，1組樣品有SOD活力，約為該組總酶活力的2/3（31.54 U/mL/47.12 U/mL），而2、3組沒有SOD活性，說明L. lactis NZ3900/pNZ8149和L. lactis NZ3900/pNZ8149菌株表達(dá)SOD在胞內(nèi)，而L. lactis NZ3900/pNZS系統(tǒng)可將外源基因分泌到胞外，這便于目的產(chǎn)物的純化和利用；L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD表達(dá)SOD總活性是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍，說明經(jīng)改造的分泌表達(dá)系統(tǒng)L. lactis NZ3900/pNZS能夠增強(qiáng)活性SOD表達(dá)。綜上所述，L. lactis NZ3900/pNZS系統(tǒng)能夠分泌表達(dá)外源的MnSOD，并增強(qiáng)其活性表達(dá)量，這為高效表達(dá)MnSOD的研究提供了理論依據(jù)。

表1 不同乳酸乳球菌菌株SOD酶活力測定結(jié)果Table 1 SOD activity in differentL. lactis ctis strains ains

3 討 論

MnSOD是SOD家族中的一員，其表達(dá)量與人類的衰老和多種疾病相關(guān)[16-20]。已發(fā)表的研究成果表明，MnSOD存在于真核生物的線粒體基質(zhì)中[21]。以組織破碎的分離提取工藝大量獲取成本較高；傳統(tǒng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)，菌種自身MnSOD表達(dá)量較低，且后提純工藝繁瑣，也難于大幅提高SOD產(chǎn)量。而應(yīng)用基因工程技術(shù)將外源的MnSOD基因?qū)胧荏w菌，獲得高效分泌表達(dá)MnSOD基因的菌株進(jìn)行生產(chǎn)將解決以上難題。

應(yīng)用大腸桿菌受體系統(tǒng)表達(dá)外源的SOD已有報道[5]，但大腸桿菌自身會產(chǎn)生有毒性的蛋白，所以在分離純化環(huán)節(jié)的損失和成本問題使其在生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)L.lactis NZ3900/pNZ8149是食品級安全表達(dá)系統(tǒng)，可通過Nisin的誘導(dǎo)作用，大幅度提高外源基因的表達(dá)效率，表達(dá)產(chǎn)物可直接應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域[22-23]。但其胞內(nèi)表達(dá)特性使該系統(tǒng)的應(yīng)用受到限制，而利用基因工程手段改造的食品級分泌表達(dá)系統(tǒng)L. lactis NZ3900/pNZS，可以分泌表達(dá)的方式表達(dá)外源基因，從而提高了外源基因的表達(dá)量。因此，應(yīng)用食品級分泌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因，獲得重組微生物菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)MnSOD前景廣闊。使用受體菌偏好密碼子可有效提高外源基因的表達(dá)[24]，但根據(jù)Kazusa DNA Research Institute密碼子數(shù)據(jù)庫中乳酸乳球菌基因組密碼子使用頻率數(shù)據(jù)，及GenBank已發(fā)表的大豆MnSOD基因（序列號AJ440726）密碼子使用數(shù)據(jù)，進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，MnSOD序列可優(yōu)化密碼子低于1%，對該基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)幾乎無影響。

本實驗分別構(gòu)建了表達(dá)載體pNZ-SOD和分泌表達(dá)載體pNZS-SOD，并轉(zhuǎn)化受體菌L. lactis NZ3900，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和酶活性對比分析。結(jié)果表明，經(jīng)改造的L. lactis NZ3900/pNZS分泌表達(dá)系統(tǒng)可通過SPusp45引導(dǎo)約2/3的外源的MnSOD基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，從而增強(qiáng)MnSOD在乳酸菌中的表達(dá)，表達(dá)SOD總活性為出發(fā)菌株的13.5 倍，而孫強(qiáng)正等[25]以L. lactis MBP71為受體表達(dá)的MnSOD活性達(dá)到了出發(fā)菌株的17 倍，分析其高效表達(dá)原因可能有兩點：一是克隆的sodA基因來源于乳酸菌，與受體菌親緣關(guān)系較近，易于表達(dá)，二是克隆的sodA基因包含了同源的啟動子，增強(qiáng)了目的基因的表達(dá)。本實驗為SOD的高效表達(dá)研究和直接應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，為外源基因在乳酸菌中分泌表達(dá)提供了參考。

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Cloning and Expression of Manganese Superoxide Dismutase Gene by Food-Grade Vector in Lactococcus lactis

MA Hongdan1, ZHANG Liyuan1, ZHAO Handan1, XU Dandan1, QU Jing2, GUAN Shuyan1,*, WANG Piwu2,*
(1. College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. College of Agriculture, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Open reading frame of manganese superoxide dismutase (MnSOD) from soybean was cloned into the plasmid pNZ8149 and plasmid pNZS was reformed to construct the food-grade vector. The recombinant plasmids were then separately transformed into L. lactis NZ3900 by electronic perforation, and the growth ability of the transformants was detected in Elliker medium. The recombinant plasmids named pNZ-SOD and pNZS-SOD were thus constructed successfully after PCR amplifi cation, ligation and identifi cation. The expression of L. lactis NZ3900/pNZ-SOD and L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD was induced by nisin and their expressed products were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The SOD enzymatic activities of the transformants L. lactis NZ3900/pNZ-SOD and L. lactis NZ3900/pNZ-SOD were determined by the inhibition of nitrotetrazolium. The SOD enzymatic activity of the transformant L. lactis NZ3900/pNZS-SOD (with two thirds of extracellular SOD) was 1.6 times higher than that of the transformant L. lactis NZ3900/pNZS-SOD and 13.5 times higher than that of the parent strain. Hence, the expression of MnSOD was enhanced in L. lactis NZ3900/pNZS.

manganese superoxide dismutase (MnSOD); food-grade vector; Lactococcus lactis

Q786

A

1002-6630（2015）01-01135-05

10.7506/spkx1002-6630-201501026

2014-01-15

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2013GB2B100125）；吉林省科技支撐計劃項目（20120215）；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)啟動基金項目（201242）

馬紅丹（1988—），女，碩士，研究方向為植物分子生物學(xué)與基因工程。E-mail：mhd522@126.com

*通信作者：關(guān)淑艷（1971—），女，教授，博士，研究方向為分子生物學(xué)與基因工程。E-mail：458194095@qq.com王丕武（1958—），男，教授，博士，研究方向為分子生物學(xué)與基因工程。E-mail：piwuw@163.com