鎘脅迫下泡菜乳酸乳球菌的形態(tài)變化

連元元，王 穎，李 晨，谷新晰，盛 耀，黃昆侖,*，田洪濤,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 1000 83）

鎘脅迫下泡菜乳酸乳球菌的形態(tài)變化

連元元1，王 穎2，李 晨1，谷新晰1，盛 耀2，黃昆侖2,*，田洪濤1,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 1000 83）

通過掃描電鏡和透射電鏡分別觀察不同質(zhì)量濃 度水平的Cd2+對(duì)泡菜乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. lactis）細(xì)胞的影響，掃描電鏡結(jié)果顯示：Cd2+質(zhì)量濃度在0、10 mg/L時(shí)，泡菜乳酸乳球菌呈橢圓形、表面光滑、菌體生長(zhǎng)繁殖旺盛，隨著Cd2+質(zhì)量濃度的增加菌體細(xì)胞表面產(chǎn)生白色顆粒狀物質(zhì)、菌體細(xì)胞存活數(shù)量大幅下降（OD600nm值由1.336下降到0.515）。當(dāng)添加200 mg/L Cd2+時(shí)，幾乎沒有見到明顯的菌體、顯示有少量棱形晶狀物。透射電鏡結(jié)果顯示：當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度為0～50 mg/L時(shí)泡菜乳酸乳球菌結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞內(nèi)容物分布均、菌體生長(zhǎng)較為正常，當(dāng)菌體暴露于100、200 mg/L Cd2+時(shí)菌體細(xì)胞出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，如細(xì)胞破裂、內(nèi)容物從薄膜穿孔中釋放、質(zhì)壁分離等。兩類電鏡結(jié)果均表明：在低質(zhì)量濃度Cd2+（≤50 mg/L）脅迫下，對(duì)泡菜乳酸乳球菌的生長(zhǎng)幾乎不產(chǎn)生影響，添加Cd2+質(zhì)量濃度上升到100、200 mg/L時(shí)泡菜乳酸乳球菌正常生長(zhǎng)受到抑制。

乳酸乳球菌；鎘脅迫；電鏡；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

鎘是一種過渡金屬，是對(duì)生物有機(jī)體最具威脅的重金屬元素之一。目前我國(guó)糧食作物鎘污染情況大致如下：1980年中國(guó)農(nóng)業(yè)環(huán)境報(bào)告，我國(guó)農(nóng)田土壤鎘污染面積為9 333 hm2，隨后有人提出鎘污染面積為13 333 hm2（根據(jù)GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》土壤中鎘的限量標(biāo)準(zhǔn)是0.006 mol/kg）；最近據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)受鎘污染的農(nóng)田面積達(dá)到2.8×105hm2，每年生產(chǎn)的鎘含量超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品達(dá)1.46×1010kg（我國(guó)GB 2762—2012《食品中污染物限量》規(guī)定大米中鎘限量標(biāo)準(zhǔn)是0.2 mg/kg），使得鎘污染嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、人類健康安全。生物吸附法是最近發(fā)展較快較先進(jìn)的去除重金屬方法，生物吸附法與傳統(tǒng)方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：原料來源豐富，品種多；設(shè)備簡(jiǎn)單，運(yùn)行費(fèi)用低；吸附量大，處理效率高； pH值和溫度條件范圍寬。

目前鎘暴露產(chǎn)生了嚴(yán)重的健康危害，而且鎘在膳食來源中的暴露不斷增加，但沒有可行的方法去除食品和飼料中的鎘。對(duì)于食品重金屬的去除，除了釀酒酵母屬于食品微生物外，其他的食品微生物，例如食品益生菌研究甚少。而最近食品中公認(rèn)的益生菌乳酸菌越來越受到關(guān)注，關(guān)于利用其去除食物中污染的重金屬離子在國(guó)內(nèi)處于初步研究，但也顯示出了可行性和潛力[1]。

實(shí)驗(yàn)選取鎘作為重金屬靶元素。實(shí)驗(yàn)中的菌株是自行由泡菜中提取并保存的一株泡菜乳酸乳球菌。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其最高耐鎘質(zhì)量濃度可達(dá)200 mg/L，由于其是食品中的益生菌（根據(jù)進(jìn)化樹比較發(fā)現(xiàn)其同源性與Lactococcus lactis subsp. cremoris strain IMAU40012同源性上最近，而后者為中國(guó)益生菌網(wǎng)中可查到的一株益生菌），因此可用于去除食品中的鎘。有研究表明鎘對(duì)食用菌生長(zhǎng)的影響不僅體現(xiàn)在生長(zhǎng)速率上，還體現(xiàn)在不同程度地影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器[2]。掃描電鏡和透射電鏡可以用來清晰地觀察微生物細(xì)胞表面和內(nèi)部的結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞器。本實(shí)驗(yàn)利用了這兩種電鏡方法探索討論了鎘添加后泡菜乳酸乳球菌菌體表面和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，可以直觀地觀察到重金屬在其細(xì)胞表面和亞細(xì)胞器上的分布和毒性作用，從而推測(cè)重金屬的吸收途徑和可能參與的機(jī)體代謝，以便后續(xù)總結(jié)出其與鎘之間的相互作用機(jī)制，揭示其耐鎘分子機(jī)制，最后應(yīng)用于食品中鎘污染的治理。同時(shí)為衡量此株泡菜乳酸乳球菌是否適應(yīng)重金屬環(huán)境以及重金屬耐受性大小提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

來源：分離自含Cd2+的泡菜，保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)東校區(qū)金工樓。

1.2 試劑

2.5 %戊二醛（醫(yī)用）、25%戊二醛（醫(yī)用）溶液武漢市帝科化工有限公司；鋨酸 北京精華耀邦醫(yī)藥科技有限公司；磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2） 北京奧博來科技有限責(zé)任公司；0.2 mol/L磷酸氫二鈉貯備液、乙醇 北京化工廠；0.2 mol/L磷酸二氫鈉貯備液北京鵬彩精細(xì)化工有限公司；環(huán)氧丙烷 東營(yíng)匯中化工有限公司；SPI812環(huán)氧樹脂 北京中興百瑞技術(shù)有限公司；以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

TM3000掃描電鏡、JEM-1230透射電鏡、JSM-6301F掃描電鏡、JEOL-2010F高分辨率透射電鏡 日本 Hitachi公司。

1.4 方法

將單菌落挑到新鮮的液體MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，以1%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下預(yù)培養(yǎng)6 h，添加Cd2+至終質(zhì)量濃度10、50、100、200 mg/L，20 h后收集菌液，去離子水清洗3 遍，制備電鏡樣品。

1.4.1 掃描電鏡樣品前處理

取各實(shí)驗(yàn)組菌體（未添加Cd2+和Cd2+添加培養(yǎng)菌體），蒸餾水洗滌5 次，以祛除菌體表面浮色，5%戊二醛固定，1%鋨酸再固定，乙醇梯度（30%、50%、70%、80%、90%、100%）脫水，乙酸異戊酯處理后，臨界點(diǎn)干燥噴金，實(shí)驗(yàn)采用TM3000型掃描電鏡觀察菌體表面特征變化。

1.4.2 透射電鏡樣品前處理

取各實(shí)驗(yàn)組菌體（未添加Cd2+和Cd2+添加培養(yǎng)菌體），清洗后立即放入福爾馬林的溶液中浸泡保存，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后，采用JEM-1230型透射電鏡觀察富集前后菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡結(jié)果

當(dāng)培養(yǎng)基中Cd2+達(dá)到50 mg/L時(shí)菌體依舊大量存活，菌體表面附著有白色細(xì)小鹽狀晶體。圖1a顯示為分辨率1 μm時(shí)的菌體形態(tài)，有白色顆粒狀晶體以團(tuán)狀存在，包裹在菌體細(xì)胞外。當(dāng)培養(yǎng)基中添加的Cd2+達(dá)到100 mg/L時(shí)，菌體量較少，出現(xiàn)白色顆粒狀鹽沉淀。圖1b（分辨率為1 μm）中更明顯的顯示出白色凝集狀鹽結(jié)晶，可以觀察到背景中正分裂的菌體和一較長(zhǎng)菌體，猜測(cè)可能與形成的細(xì)菌生物膜來黏附重金屬以適應(yīng)環(huán)境壓力有關(guān)[3]。Aymerich[4]、Behr[5]和Kubota[6]等也發(fā)現(xiàn)乳酸菌在逆境環(huán)境中可以形成生物質(zhì)。圖1c顯示為Cd2+200 mg/L處理時(shí)通過掃描電鏡觀察到的泡菜乳酸乳球菌形態(tài)，幾乎沒有見到明顯的菌體，顯示有少量棱形晶狀物，與形成結(jié)晶生物化石可能存在關(guān)聯(lián)。重金屬在微生物表面通過與螯合物形成沉淀或在細(xì)胞壁上與特殊結(jié)構(gòu)如S-蛋白形成核中心，可促進(jìn)生物礦石晶體生長(zhǎng)。而且這種沉淀和生物礦石有時(shí)有重疊的現(xiàn)象，尚不清楚是哪個(gè)作用單獨(dú)或主要起到了固定重金屬的作用[7]。

2.2 透射電鏡結(jié)果

圖2 添加Cd2+泡菜乳酸乳球菌透射電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of Lactococcus lactis subsp. lactis exposed to different concentrations of Cd2+

圖2a所示為未添加Cd2+，處于分裂期有完整細(xì)胞的泡菜乳酸乳球菌（透明部分為切片不當(dāng)所致，與菌體形態(tài)無(wú)關(guān)）。圖2 b、2c所示為Cd2+在質(zhì)量濃度10、50 mg/L時(shí)透射電鏡圖，菌體受Cd2+影響不大，多數(shù)為正常生長(zhǎng)和處于分裂期的菌體細(xì)胞，細(xì)胞完整飽滿，內(nèi)容物分布均勻致密，細(xì)胞壁薄。Cd2+質(zhì)量濃度50 mg/L時(shí)有少量質(zhì)壁分離現(xiàn)象，質(zhì)壁分離處有氣泡或囊泡，可能和菌體自身隔離Cd2+采取的防御措施有關(guān)，是細(xì)胞內(nèi)阻止胞質(zhì)積累的重金屬對(duì)重要細(xì)胞器毒害的有效策略[8-10]，這在真核微生物如藻類、真菌、酵母中經(jīng)常出現(xiàn)。真菌積累的大部分Co2+、Mn2+通常情況下存在于小氣泡中，并以離子的形式存在或結(jié)合于多聚磷酸鹽上或通過蛋白質(zhì)發(fā)揮貯存、調(diào)節(jié)金屬離子濃度的作用，例如聚球菌屬（Synechococcus sp.）產(chǎn)生的金屬硫蛋白[11]。當(dāng)Cd2+、Zn2+濃度較高時(shí)，聚球菌屬（Synechococcus sp.）的抗Cd、Zn基因smtA、smtB誘導(dǎo)表達(dá)，并且受smtB產(chǎn)物的抑制，smtA金屬硫蛋白半胱氨酸殘基可與過量的金屬陽(yáng)離子產(chǎn)生沉淀[12-13]。

圖2d、2e是Cd2+質(zhì)量濃度添加至100、200 mg/L時(shí)乳酸菌微觀透射顯微鏡圖，顯示有些菌還是正?，F(xiàn)象。有些菌已經(jīng)開始有異?；虻虮值默F(xiàn)象。以上圖片可以呈現(xiàn)出乳酸菌體異常凋敝的動(dòng)態(tài)過程。未添加Cd2+和低質(zhì)量濃度Cd2+組別菌體橫切面為規(guī)則圓形，細(xì)胞壁規(guī)則致密，細(xì)胞膜完整，菌體飽滿，表面無(wú)黑色顆粒物，當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度高至100 mg/L時(shí)，菌體細(xì)胞壁質(zhì)地疏松，厚度增大，出現(xiàn)氣泡、囊泡，表明菌體對(duì)Cd2+具有較高抗性；Cd2+質(zhì)量濃度繼續(xù)升高至200 mg/L時(shí)，出現(xiàn)質(zhì)壁分離，菌體細(xì)胞膜有明顯穿孔，有內(nèi)容物釋放現(xiàn)象，猜測(cè)為胞內(nèi)染色質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)物。非必需金屬元素可取代結(jié)合位點(diǎn)的必需元素，與配基反應(yīng)，產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，干擾氧化磷酸化及滲透壓的平衡，從而導(dǎo)致菌體代謝失常和凋敝[14-15]。樊霆[16]在研究真菌CTB430對(duì)Cu和Zn抗性時(shí)比較菌體富集Cu和Zn前后菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化時(shí)也有類似損傷菌體真絲及細(xì)胞壁膜現(xiàn)象出現(xiàn)。

Cd2+質(zhì)量濃度較低（50 mg/L以下）時(shí)菌體正常生長(zhǎng)，質(zhì)量濃度逐漸升高時(shí)有黑色電子密度顆粒、液泡等一些異?，F(xiàn)象出現(xiàn)，體現(xiàn)了菌體自身防御機(jī)制在抗Cd2+毒性方面的作用，Cd2+質(zhì)量濃度較高（200 mg/L）時(shí)出現(xiàn)質(zhì)壁分離，細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔，內(nèi)容物外泄等結(jié)果推測(cè)泡菜乳酸乳球菌可能具有通過氣泡或囊泡隔離Cd2+的作用。金屬離子進(jìn)入細(xì)胞后，通過區(qū)域化作用（c ompartmentalization）分布在細(xì)胞內(nèi)的不同部位，可將有毒金屬離子封閉（如進(jìn)入液泡或線粒體）或與熱穩(wěn)定蛋白結(jié)合，轉(zhuǎn)變成為低毒的形式，是更有效的解毒方式[17]。

3 結(jié) 論

掃描電子顯微鏡照片顯示，較低Cd2+質(zhì)量濃度（10、50 mg/L）處理時(shí)，泡菜乳酸菌細(xì)胞長(zhǎng)短徑及細(xì)胞分裂，表面完整性與對(duì)照組比對(duì)都沒有出現(xiàn)明顯改變，這說明較低Cd2+質(zhì)量濃度對(duì)于菌體影響不大；加大Cd2+質(zhì)量濃度（100、200 mg/L）時(shí)，存活的菌體細(xì)胞量很少，有大量白色顆粒晶體鹽以及菱形狀巖石出現(xiàn)，這可能是鎘的各種沉淀形式（后續(xù)實(shí)驗(yàn)通過掃描電鏡與X射線譜圖聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)Cd2+質(zhì)量濃度100、200 mg/L時(shí)晶狀體的主要元素是分別是C、O、Na、Cd和C、O、Cd）。

透射電子顯微鏡掃描結(jié)果顯示，未添加Cd2+菌和較低Cd2+質(zhì)量濃度（10、50 mg/L）時(shí)泡菜乳酸菌細(xì)胞完整度較好，內(nèi)容物分布較充實(shí)；當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度升至100、200 mg/L時(shí)菌體細(xì)胞破裂穿孔較普遍，內(nèi)容物大量釋放在胞外環(huán)境中，內(nèi)部有黑色電子密度顆粒堆積，質(zhì)壁分離，細(xì)胞周質(zhì)出現(xiàn)含有黑色電子密度顆粒的氣泡或囊泡，推測(cè)是Cd的絡(luò)合物。

低質(zhì)量濃度Cd2+（10、50 mg/L）條件下，泡菜乳酸菌能較正常生長(zhǎng)代謝，高質(zhì)量濃度Cd2+（100、200 mg/L）時(shí)，泡菜乳酸乳球菌受Cd2+影響較大出現(xiàn)不正常的衰敗，死亡。在泡菜乳酸菌細(xì)胞表面有鎘沉淀，內(nèi)部有鎘的絡(luò)合物，這與菌體自身的耐鎘機(jī)制有關(guān)。具體的耐鎘機(jī)制后續(xù)會(huì)進(jìn)一步研究，可通過雙向電泳尋找差異蛋白，之后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)，確定關(guān)鍵耐鎘基因，即最終確定耐鎘的分子機(jī)制。

[1] 江南大學(xué). 一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途: 中國(guó), CN102827796 B[P/OL]. 2012-12-19[2013-10-30]. http://www.google. co.uk/patents/CN102827796B?cl=zh&hl=zh-CN.

[2] 黃敏敏, 江枝和, 翁伯琦, 等. 鎘對(duì)姬松茸菌絲體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2011, 32(6): 1082-1085.

[3] DONLAN R M. Biofilms: microbial life on surfaces[J]. Emerging Infectious Diseases, 2002, 8(9): 88l-890.

[4] AYMERICH T, MARTíN B, GARRIGA M, et al. Microbial quality and direct PCR identifi cation of lactic acid bacteria and nonpathogenic staphylococci fromartisanal low-acid sausages[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69: 4583-4594.

[5] BEHR J, G?NZLE G M G, VOGEL R F. Characterization of a highly hop-resistant Lactobacillus brevis strain lacking hop transport[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72: 648-649.

[6] KUBOTA H, SENDA S, NOMURA N, et al. Biofilm formationby lactic acid bacteria and resistance to environmental stress[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 106: 381-386.

[7] GLASAUER S, LANGLEY S, BEVERIDGE T J. Sorption of Fe(hydr)oxides to the surface of Shewanella putrefaciens: cell-bound fi ne-grained minerals are not a lways formed de novo[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67: 5544-5550.

[8] COBBETT C, GOLDSBROUGH P. Phytochelatins and metallothionei roles in heavy meta l detoxifi cation and homeostasis[J]. Annual Review of Plant Biology, 2002, 53: 159-182.

[9] CLEMENS S. Evolution and function of phytochelatin synthases[J]. Journal of Plant Physiology, 2006, 163(3): 319-332.

[10] CAI Yong, SU Jinhui, LENA Q Ma, Low molecular weight thiols in arsenic hyperaccumulator Pteris vittata upon exposure to arsenic and other trace elements[J]. Environmental Pollution, 2004, 129: 69-78.

[11] MARTIN S, RENE K, VACEK J, et al. Electrochemical study of heavymetals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolytica[J]. Bioelectrochemistry, 2003, 60: 29-36.

[12] 徐柳, 宋琴, 茆燦泉. 金屬結(jié)合蛋白(肽)與環(huán)境重金屬生物修復(fù)[J].生物工程雜志, 2004, 24(4): 39-43.

[13] COOK W J, KAR S R, TAYLOR K B, et al. Crystal structure of the cyanobacterial metallothionein repressor SmtB: a model for metalloregulatory proteins[J]. Journal of Plant Physiology, 1998, 275: 337-346.

[14] 滕應(yīng). 重金屬污染下紅壤微生物生態(tài)特征及生物學(xué)指標(biāo)研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2003.

[15] BRUINS M R, KAPIL S, OEHME F W. Microbial resistance to metals in the environment[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2000, 45(3): 198-207.

[16] 樊霆. 真菌對(duì)重金屬的抗性機(jī)制及富集特性研究[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南大學(xué), 2009.

[17] 王保軍, 楊惠芳. 微生物與重金屬的相互作用[J]. 重慶環(huán)境科學(xué), 1996, 18(1): 35-39.

Morphological Change of Lactococcus lactis subsp. lactis under Cadmium Stress

LIAN Yuanyuan1, WANG Ying2, LI Chen1, GU Xinxi1, SHENG Yao2, HUANG Kunlun2,*, TIAN Hongtao1,*
(1. College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM), the effects of different levels of cadmium (Cd2+) on Lactococcus lactis subsp. lactis cells were examined. The SEM results showed that when the mass concentration of Cd2+was 0 and 10 mg/L, the bacterium displayed an oblong shape with smooth surface and grew vigorously. With increasing concentration of Cd2+, white granules appeared on the surface and the number of surviving cells began to fall (i.e., OD was reduced from 1.336 to 0.515). Under the stress of Cd2+at 200 mg/L, almost no visible bacteria were seen and a small amount of prismatic crystals app eared. The TEM results revealed that when the mass concentration of Cd2+was 0–50 mg/L, the cell structure of this strain was intact and the cellular contents were evenly distributed, and the strain grew normally. When exposed to 100 and 200 mg/L Cd2+, it began to change abnormally such as ruptured cells and release of cellular contents f rom holes in the cellular membrane. In addition, plasmolysis was observed. Together, these results indicated that Lactococcus lactis subsp. lactis was hardly affected by Cd2+at low concentrations (≤ 50 mg/L) but inhibited at high concentrations (100 and 200 mg/L).

Lactococcus lactis subsp. lactis; cadmium stress; electron microscope; subcellular structure

Q934.3

A

1002-6630（2015）01-0124-04

10.7506/spkx1002-6630-201501024

2014-01-26

國(guó)家自然科學(xué)基金主任基金項(xiàng)目（31140065）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2012204099）

連元元（1986—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橐嫔Y源的開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：544408643@qq.com

*通信作者：黃昆侖（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因產(chǎn)品食用安全評(píng)價(jià)與檢測(cè)、食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)與檢測(cè)技術(shù)、食品生物技術(shù)。E-mail：hkl009@163.com

田洪濤（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橐嫔Y源的開發(fā)與應(yīng)用，工業(yè)微生物技術(shù)。E-mail：tht631022@163.com