傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀：過去、現(xiàn)在與未來*

李樹奇 鮑曉迪 殷紅 孔祥蕾

(南開大學(xué)元素有機化學(xué)國家重點實驗室 天津 300071)

今日化學(xué)

傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀：過去、現(xiàn)在與未來*

李樹奇 鮑曉迪 殷紅 孔祥蕾**

(南開大學(xué)元素有機化學(xué)國家重點實驗室 天津 300071)

對傅里葉變換離子回旋共振高分辨率質(zhì)譜儀的發(fā)展歷程、串聯(lián)質(zhì)譜解離技術(shù)及最新的應(yīng)用進行了詳細描述，并對其發(fā)展趨勢進行了展望。

傅里葉變換質(zhì)譜 離子回旋共振 高分辨率質(zhì)譜 串聯(lián)質(zhì)譜 超導(dǎo)磁體

1974年，Comisarow和Marshall首次將傅里葉變換技術(shù)應(yīng)用到離子回旋共振質(zhì)譜中，發(fā)明了傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer，F(xiàn)T ICR MS) 技術(shù)。在過去的40年中，這項質(zhì)譜分析技術(shù)得到了快速的發(fā)展。它集超高分辨率，超高質(zhì)量精度和高靈敏度等優(yōu)良性能于一體，在蛋白質(zhì)組學(xué)，生物醫(yī)藥，石油組學(xué)，材料科學(xué)等眾多領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。另一方面，近年來各種新型離子化方法的發(fā)明以及串聯(lián)質(zhì)譜新技術(shù)的引入，為FT ICR MS開辟了更為廣闊的應(yīng)用空間。

FT ICR MS作為質(zhì)譜儀器中的貴族，不僅是因為其超高分辨率與精確度，也是指儀器本身高昂的售價，以及定期維護導(dǎo)致的高運行成本。因此，雖然商業(yè)化的FT ICR MS早在20世紀80年代就已經(jīng)出現(xiàn)，但其早期在我國的推廣非常有限。然而近15年來情況有了很大的改變，一方面國內(nèi)用戶的數(shù)量逐年增多；另一方面其應(yīng)用的領(lǐng)域也得到很大的擴展。盡管如此，國內(nèi)用戶對于FT ICR MS的認識主要集中于其應(yīng)用方面，而對儀器本身的發(fā)展歷程、新方法的融入以及功能擴展等方面的知識卻鮮有介紹。與已有的相關(guān)綜述文章[1-4]不同的是：本文從FT ICR MS儀器本身和其技術(shù)發(fā)展的角度，對其發(fā)展歷史、串聯(lián)質(zhì)譜解離技術(shù)及最新的應(yīng)用進行了詳細描述，并對其進一步發(fā)展的前景進行了展望和評述。

1 FT ICR MS的歷史與發(fā)展

要更好地了解FT ICR MS的發(fā)展史，必須要追溯到之前就已經(jīng)發(fā)明的回旋共振質(zhì)譜。下面我們分別就其整個發(fā)展史中的標志性事件進行必要的回顧和說明。

1.1 回旋加速器與回旋共振質(zhì)譜

1.1.1 粒子回旋加速器(1930)

回旋運動是離子在FT ICR MS分析室中的重要運動形式，其運動方程可以表示為ωc=qB/m。其中ωc為離子回旋運動的角頻率，B為磁場強度，q為離子的電量，m為離子的質(zhì)量。首先提出這一理論的是美國伯克利加州大學(xué)物理學(xué)教授勞倫斯(Ernest Lawrence)[5]，其靈感來源于直線加速器加速工作原理，當直線加速器加速帶電粒子時，粒子是沿著一條近于直線的軌道運動被逐級加速的；因此，在需要很高的能量時，加速器的直線距離會很長。1930年，勞倫斯提出了回旋加速器的理論，他做了兩個結(jié)構(gòu)相當簡單的加速器模型，把氫離子注入后，顯示出了使離子回旋加速的效果。1931年，他和他的學(xué)生利文斯頓(M. S. Livingston)一起，研制了世界上第一臺回旋加速器，利用2kV的加速電壓使氘離子加速到80keV的能量，向人們證實了他們所提出的回旋加速器原理。1932年又建成了一臺直徑為24cm的較大回旋加速器，其被加速粒子的能量可達到1MeV[6]。由于回旋加速器方面的貢獻，勞倫斯獲得了1939年諾貝爾物理學(xué)獎。勞倫斯理論表明，離子在恒定磁場中回旋運動的頻率與離子的質(zhì)量成線性關(guān)系，當外加橫向交變電場的頻率與離子回旋的頻率相等時，離子能夠被激發(fā)到更大的軌道半徑。這一發(fā)現(xiàn)的意義不僅在于利用較小的電場使帶電粒子獲得高的能量，也為后來FT ICR MS的發(fā)展邁出了重要的第一步。

1.1.2 Omegatron質(zhì)譜(1949)

離子回旋質(zhì)譜最早可追溯到1949年設(shè)計的Omegatron質(zhì)譜[7-8]。利用回旋運動原理，Hipple，Sommer和Thomas設(shè)計了一種用來準確測量法拉第常數(shù)的裝置，其設(shè)計如圖1a 所示，通過軸向的電子束(平行于磁場方向)在分析室區(qū)產(chǎn)生離子，以一個捕獲電壓產(chǎn)生的電場來防止離子在軸向溢出；在兩平行電極板上施加與磁場方向垂直的射頻(RF)電壓，調(diào)節(jié)RF的頻率，當所提供的RF頻率與離子的回旋頻率相等時，離子吸收能量被加速，以螺旋形軌道行進；在適當?shù)奈恢梅胖靡粋€離子收集器，當離子被加速到軌道半徑為1.0cm時撞擊離子收集器產(chǎn)生共振信號，而那些沒有被共振激發(fā)的離子則不能被收集。因為該裝置測量的是頻率ω，他們將其命名為Omegatron。該儀器捕獲離子的能力很有限，質(zhì)量分辨率低，因此一直未能作為一種常規(guī)分析質(zhì)譜，其主要用途是氣體分析和泄漏檢測。

圖1 離子回旋質(zhì)譜 、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀以及軌道阱技術(shù) (a) Omegatron結(jié)構(gòu)簡圖[8] ；(b) 三區(qū)結(jié)構(gòu)ICR分析室[9]；(c) 捕陷離子型分析室[10]； (d) FT ICR MS的激發(fā)和檢測過程[11]；(e) 和諧阱技術(shù)[12]；(f) 軌道阱技術(shù)[13]

1.1.3 離子回旋共振質(zhì)譜(1963)

利用ICR原理發(fā)展成真正意義上的質(zhì)譜是在20世紀60年代中后期，在此期間產(chǎn)生了漂移室型和捕陷離子室型兩種ICR質(zhì)譜。漂移室型最早出現(xiàn)于1963年，分析室由離子源區(qū)和漂移區(qū)組成[14]，后來發(fā)展為如圖1b所示的三區(qū)結(jié)構(gòu)：離子源區(qū)、共振區(qū)和離子收集區(qū)[9]。采用電子轟擊(EI)的辦法在離子源區(qū)中產(chǎn)生離子，電子束的方向平行于磁場方向。然后在與電場和磁場垂直的方向施加很小的漂移電壓，將離子引入共振區(qū)中。為避免電子束對觀察振蕩器的影響，共振區(qū)和離子源區(qū)分開引入漂移電壓。在磁場和靜電場的作用下，離子在與其垂直的方向上沿擺線軌道漂移，為防止離子沿磁場方向逸出, 在兩個邊面板上加一個小的捕陷電壓。當時檢測激發(fā)回旋運動使用的是既能產(chǎn)生回旋激發(fā)需要的射頻電場又能測量功率吸收的邊緣振蕩器。當固定邊緣振蕩器頻率時，掃描磁場強度使樣品離子的回旋頻率依次與邊緣振蕩器的頻率相等，測量功率吸收隨磁場強度的變化來獲得樣品的質(zhì)譜圖。

1970年，McIver展示了單區(qū)捕陷離子室型質(zhì)譜[10](圖1c)，其分析室為6個金屬極板組成的長方體構(gòu)型。與三區(qū)結(jié)構(gòu)分析室不同，它在垂直于磁場方向多出兩個端板作為捕集板，在其上加與離子同極性的小電壓就可以形成一個電勢阱，將離子囚禁于其中。這種構(gòu)型的特點是：(1) 離子的產(chǎn)生和檢測都在同一區(qū)室中進行；(2) 離子能夠被較長時間捕獲在分析室中(由過去的最長1～2毫秒提高到了100毫秒)；(3) 離子從產(chǎn)生到檢測再到清除的整個過程通過時間脈沖序列來控制。由于采用脈沖式激發(fā)，所有的離子都在同一時間內(nèi)生成，這就避免了以往電子束的空間電荷對離子檢測的干擾。同時，脈沖序列概念的提出對后來傅里葉變換技術(shù)在ICR MS上的應(yīng)用以及發(fā)展多級質(zhì)譜在時間串聯(lián)上的實現(xiàn)具有重要意義。此后，ICR MS成為氣相離子化學(xué)領(lǐng)域，尤其是研究離子-分子反應(yīng)的有效工具。不過采用固定頻率激發(fā)，磁場掃描的檢測模式導(dǎo)致ICR分析速度很慢，另外分析室的真空壓力一般控制在1.3×10-5Pa，使儀器的分辨率和質(zhì)量檢測范圍都受到限制，這就嚴重制約了其在分析領(lǐng)域中應(yīng)用的擴展。

1.2 傅里葉變換質(zhì)譜

1.2.1 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜 (1974)

ICR MS的飛躍發(fā)展是在1974年Marshall和Comisarow成功地將傅里葉變換技術(shù)應(yīng)用到其中之后[15-16]。早在1970年以前，F(xiàn)T技術(shù)就被應(yīng)用到了紅外光譜儀和核磁共振波譜儀(NMR)[17]。對于NMR，核的共振頻率ω只決定于旋磁比γ與外加磁場強度B，這與ICR的ωc只受限于離子的荷質(zhì)比q/m和外加磁場強度B相類似，這就給ICR MS工作者以啟發(fā)。不過ICR與FT技術(shù)結(jié)合面臨幾個關(guān)鍵技術(shù)問題，主要為：(1) 需要合適的方法將所有離子較長時間囚禁在分析室中；(2) 需要合適的方法對所有離子共振激發(fā)；(3) 需要合適方法對所有離子進行同時檢測；(4) 與NMR相比，F(xiàn)T ICR MS的數(shù)據(jù)量更為龐大，需要足夠大的計算機內(nèi)存來支持傅里葉變換對于數(shù)據(jù)的處理。

McIver的單區(qū)捕陷離子型分析室可以實現(xiàn)對離子的較長時間囚禁。對于離子的激發(fā)，Marshall和Comisarow采用了快速頻率掃描的模式。在較短的時間內(nèi)，在激發(fā)板上引入涵蓋了所有離子回旋頻率的寬頻域射頻信號(chirp)，在此信號的激發(fā)下，相同質(zhì)量的離子會粘合到一起形成離子團，所有離子都激發(fā)到較大半徑做回旋運動。對于信號的檢測，與過去掃描磁場監(jiān)視邊緣振蕩器功率吸收的模式完全不同，他們直接檢測離子團在接收板上感應(yīng)出的鏡像電流，該電流包含了所有離子信息的時間域瞬態(tài)信號(自由衰減信號)，通過寬帶RC電路將其放大存儲為電壓信號后，利用傅里葉變換進一步轉(zhuǎn)化成頻率域信號，進而得到以質(zhì)荷比為橫坐標的質(zhì)譜圖。圖1d描述了離子團被激發(fā)和檢測的過程，這種寬帶激發(fā)和檢測的模式大大提高了分析效率,也顯著改善了儀器的分辨率，并擴展了它的質(zhì)量范圍。目前，這種模式仍然是FT ICR常規(guī)測試中最常用的激發(fā)和檢測方法。1975年，Marshall等用這種儀器獲得了m/q為1885的三全氟代庚基吖嗪的分子峰，在相對分子質(zhì)量為28范圍內(nèi)獲得了分辨率為250000的CO、N2和C2H4混合物的超高分辨譜，還獲得了質(zhì)量范圍為69～605的全氟煤油質(zhì)譜，顯示出該種儀器在分析應(yīng)用方面的巨大潛力[18]。1978年，他們搭建了第一臺FT ICR MS[19]，從此傅里葉變換高分辨質(zhì)譜技術(shù)被確立成為研究復(fù)雜離子化學(xué)的強有力分析方法[11]。

1.2.2 世界首臺商業(yè)化FT ICR MS(1981)

1981年，Nicolet儀器公司推出了世界首臺商業(yè)化FT ICR MS，型號為FT MS-1000(圖2a)，最初采用磁場強度為1.2特斯拉(T)的電磁體，后來又升級為1.9T和3.0T的超導(dǎo)磁體。1982年，Bruker CMS-47 FT ICR MS也加入到市場競爭中來，其磁體為4.7T的超導(dǎo)磁體。FT ICR儀器的質(zhì)量分辨率和掃描速度與磁場強度B成正比，質(zhì)量精確度、動態(tài)范圍與質(zhì)量檢測上限與B2成正比；此外超導(dǎo)磁體更加穩(wěn)定，因此提高磁場強度是提高該類儀器綜合性能的最簡單也是最有效方式。商品儀器的出現(xiàn)，尤其是超導(dǎo)磁體的使用以及計算機的飛速發(fā)展，推動了FT ICR的研究和應(yīng)用。作為一個對比，圖2b顯示了2013年Bruker公司展示推出的新型FT ICR MS(型號為SolariX XR)。

圖2 世界首臺與目前商業(yè)化FT ICR MS儀器 (a) Nicolet FTMS-1000(1981)；(b) Bruker SolariX XR(2013)

1.3 新電離源的引入——電噴霧與基質(zhì)輔助激光解吸電離(1989)

現(xiàn)在，F(xiàn)T ICR MS已經(jīng)幾乎可以和各種電離技術(shù)聯(lián)用。但在早期的儀器中，離子源均為內(nèi)離子源，對于不易揮發(fā)的樣品，如聚合物和各種生物樣品等，一般把樣品點在進樣桿上靠近分析室進行電離。這種方法容易對分析室造成污染，此外也影響了分析室的真空度進而降低分辨率。如果要將離子從外離子源引入到分析室中，就得克服超導(dǎo)磁體邊沿磁場對離子的反射。離子傳導(dǎo)技術(shù)的出現(xiàn)，成功解決了這一問題，可以有效地將外離子源產(chǎn)生的離子注入到分析室中?？煸愚Z擊(FAB)以及后來出現(xiàn)的電噴霧(ESI)[20]和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)[21-22]都屬于外離子源電離方法。這些新型的電離方法與FT ICR MS的結(jié)合使其很快由傳統(tǒng)的氣相離子化學(xué)的基礎(chǔ)性研究領(lǐng)域擴展到有機物及生物分子的結(jié)構(gòu)分析新領(lǐng)域。

用ESI電離技術(shù)對生物大分子進行質(zhì)譜分析最早出現(xiàn)于1988年，第二年它就被成功地應(yīng)用于FT ICR MS中[23]。ESI屬于軟電離技術(shù)，特別適合對極性分子及熱不穩(wěn)定的分子進行分析。它的最具魅力的特點就是能夠形成多電荷離子，而且所帶的電荷數(shù)隨著相對分子質(zhì)量的增加而增加。對于ICR，由回旋運動公式可以看出相對分子質(zhì)量越大的離子其回旋運動頻率越小，這就使得其檢測大分子離子較為困難。ESI電離技術(shù)的出現(xiàn)，使得大分子離子帶多個電荷出現(xiàn)在FT ICR可檢測頻率區(qū)域，而其特有的超高分辨能力可以將多電荷的同位素峰簇分辨開來確定其具體的電荷數(shù)，進而精確測定出大分子物質(zhì)的相對分子質(zhì)量。此外，多電荷電離可以提供多個電荷并產(chǎn)生很強的鏡像電流，從而可以提高FT ICR的靈敏度，甚至可以檢測到帶有很多電荷的單個離子[24]。1988年，Tanaka，Hillenkamp分別提出使用基質(zhì)輔助來獲得大分子離子[21-22]，該方法將樣品加入到能強烈吸收激光的基質(zhì)中，基質(zhì)將激光的能量傳遞給樣品，以產(chǎn)生分子離子，從而避免了直接用激光照射分析物，為分析生物大分子提供了一個理想的方法。MALDI的特點是能耐受適量的緩沖劑和鹽，靈敏度很高，容易出現(xiàn)單電荷離子，碎片離子較少。MALDI最早是在1991年與FT ICR實現(xiàn)聯(lián)用[25]，它與ESI是相互補充的質(zhì)譜技術(shù)，它們與FT ICR的聯(lián)用被廣泛用于生物樣品、高聚物等大分子及石油、中草藥等復(fù)雜體系的研究。盡管其他類型的質(zhì)量分析器也可以實現(xiàn)與MALDI、ESI的聯(lián)用，但FT ICR特有的超高分辨率與精確度，無疑使其在成分確認和結(jié)構(gòu)分析上更具優(yōu)勢。

1.4 新型分析池(2011)

歷史上曾出現(xiàn)過多種幾何形狀的分析池(cell)，目前廣泛使用圓柱形cell，因為此種cell能夠更好與磁體中央的圓洞(bore)匹配，增加空間體積，減少離子空間電荷效應(yīng)。但在離子檢測時，cell兩端的捕集電壓形成的電場會影響儀器的分辨率。為此，在離子檢測時一般采用盡可能小的捕集電壓。另外一種方法則是創(chuàng)建一個雙曲電場，使得離子回旋運動的頻率與它們的軸向運動無關(guān)。然而，早期方法所提供的雙曲電場僅僅集中在cell中心很小的空間內(nèi)[26-27]。2011年，Nikolaev等在理論分析與數(shù)字模擬的基礎(chǔ)上，設(shè)計并實現(xiàn)了一種新型FT ICR cell (被稱之為“和諧阱”)[12,28]。該圓柱形分析池表面被均分成多個獨立單元，這些獨立單元內(nèi)部產(chǎn)生同等大小的雙曲電勢場，將相隔單元并聯(lián)組成兩組電路，分別作為激發(fā)電極和探測電極，它們與捕集電極一起構(gòu)成整個分析池(圖1e)。該方法大大提高了儀器分辨率。用此新型cell在7T FT ICR上對利血平(reserpine，質(zhì)子化分子離子峰為609)進行測試，獲得了高達2400萬的超高分辨率；對牛血清白蛋白(BSA)，在寬帶模式下獲得了電荷數(shù)從37到60的多電荷譜圖分布，在窄帶模式下對電荷數(shù)為49的同位素峰簇(m/z1357)進行測試，獲得了該峰簇的清晰分布，其分辨率高達120萬。分辨率的極大提高，也使得這種新型cell測試的質(zhì)量上限超過了10萬[28]。

2 FT ICR MS中使用的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

分析池是FT ICR的核心部件，它集質(zhì)量分析器和離子檢測器于一體，利用不同的時間段施加不同的脈沖事件完成激發(fā)和檢測。由于FT ICR采用時間串聯(lián)的方式工作，離子檢測不是以犧牲離子為代價，因此可以對檢測后的離子做多種多級質(zhì)譜研究。20世紀90年代后，F(xiàn)T ICR技術(shù)發(fā)展的一個重要方面就是多種解離技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展。迄今，與FT ICR聯(lián)用的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)主要有碰撞誘導(dǎo)解離、紅外多光子解離、黑體紅外輻射解離、表面誘導(dǎo)解離和電子捕獲解離。

2.1 碰撞誘導(dǎo)解離(collision-induced dissociation，CID)

CID(有時亦被稱為碰撞活化解離，CAD)是用在FT ICR上的一種傳統(tǒng)解離技術(shù)[29]。被隔離的母離子被盡可能低的捕獲電壓囚禁于分析池中，在這種情況下，離子不會產(chǎn)生任何碎片。只有將離子激發(fā)到更大半徑并與惰性氣體(如N2)發(fā)生碰撞才能獲得較大的能量。離子接受能量后發(fā)生分子內(nèi)振動能量的重新分布，如果提供的能量高于要斷裂鍵的鍵能，離子裂解。CID主要斷裂肽鍵，產(chǎn)生以b和y類型為主的離子峰。

有多種方法可以增加離子動能，最為常用的是共振激發(fā)和持續(xù)非共振輻射(sustained off-resonance irradiation，SORI)[30]。在共振激發(fā)中，用與離子回旋頻率完全一致的RF脈沖信號將離子激發(fā)到較大半徑，該脈沖信號的強度與持續(xù)時間決定了離子的最后動能。該方法常用來研究相對較小的分子在單次碰撞后裂解的碎片信息。如果發(fā)生多次碰撞，離子的動能會急劇衰減，隨后碰撞的效率會很低而不利于大分子離子的裂解。在SORI中，母離子受到一個稍微偏離其共振頻率的低強度RF信號激發(fā)，使其回旋半徑不斷膨脹或收縮。由于RF強度很低，離子不會偏離分析池中心太遠。在激發(fā)時，通過脈沖閥引入碰撞氣體增大分析池中的氣壓。在這種情況下，離子的碰撞概率大大增加，盡管每次的碰撞僅僅有一小部分能量被轉(zhuǎn)換(通?！?.3eV)，但是經(jīng)歷千百次這樣的碰撞，母離子最終累積達到足夠多的內(nèi)能而裂解。由于內(nèi)能是逐步積累升高的，它隨機遍布于全部離子當中，因此母離子以低能碎裂途徑裂解。當碎片產(chǎn)生后，它們的回旋頻率不再與RF產(chǎn)生偏共振，也就不會被加速與氮氣發(fā)生碰撞，而會慢慢冷卻下來變得更穩(wěn)定。因此，子離子一旦產(chǎn)生就會冷卻下來，不會繼續(xù)裂解下去。

2.2 紅外多光子解離(infrared multiphoton dissociation，IRMPD)

IRMPD最初用來對小分子進行化學(xué)研究，后來擴展到對生物大分子進行結(jié)構(gòu)表征[31]。IRMPD與SORI-CID相似，只是能量供給方式不同。IRMPD多采用CO2紅外激光器。將激光器置于磁體的末端，激光被激發(fā)后就會通過磁體的孔洞照射到ICR分析池。離子對光子的多次吸收產(chǎn)生內(nèi)能的積累，同SORI一樣，IRMPD給離子所提供的能量也是緩慢和隨機的，離子的分解經(jīng)低能過程進行(對于10.6μm波長的CO2紅外激光的光子能量為0.12eV)。與SORI不同的是，碎片離子經(jīng)SORI-CID產(chǎn)生后，在氮氣中很快冷卻，不會進一步分解；而在IRMPD過程中，如果激光一直打開的話，則碎片離子將繼續(xù)吸收光子積累內(nèi)能進一步發(fā)生低內(nèi)能的裂解，從而使產(chǎn)生的解離譜的碎片信息更為豐富。此外，IRMPD過程是在分析池中心進行的，不需要脈沖事件對離子進行激發(fā)，使儀器采集速度加快；同時由于沒有類似CID實驗碰撞氣體的引入，使分析池的高真空狀態(tài)得以維持，從而避免了瞬態(tài)信號快速衰減導(dǎo)致的分辨率降低。

2.3 表面誘導(dǎo)解離(surface induced dissociation，SID)

SID是用固體表面作為碰撞靶，選定的母離子被加速與其碰撞后動能轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)能而解離，生成的產(chǎn)物離子從表面散射出去，隨后由檢測器將其檢出。對于不同類型的碰撞表面，采用含硅或碳氟化合物的涂布材料的表面解離效率最好，而石墨表面和碳水化合物表面的內(nèi)能轉(zhuǎn)化率則較低。此外,內(nèi)能的轉(zhuǎn)化率還和離子束與碰撞表面的角度有關(guān)。SID傳遞給母離子的內(nèi)能分布較窄，易于控制內(nèi)能的轉(zhuǎn)化。當選定的母離子與表面碰撞以后會產(chǎn)生多種反應(yīng)，這些反應(yīng)所占的比例與碰撞表面的性質(zhì)和碰撞的角度有關(guān)。若要得到離子的結(jié)構(gòu)信息,應(yīng)當選擇發(fā)生非彈性碰撞[32]。此外，離子與表面碰撞會發(fā)生電荷交換導(dǎo)致母離子中性化，該反應(yīng)不僅使母離子的電荷轉(zhuǎn)移到表面上，同時會產(chǎn)生涂布材料的小分子離子，影響低質(zhì)量范圍離子分析。SID首次應(yīng)用于FT ICR是在1990年[33-34]，離子進入阱后再被加速至阱壁或加速至置于分析池后捕獲集端的內(nèi)置探頭，發(fā)生碰撞。與CID類似，它們都是使母離子中化學(xué)鍵較弱的位置先發(fā)生斷裂，容易形成b和y類型為主的碎片離子。不同的是，SID不需要將碰撞氣引入到分析池當中，從而減小了對真空系統(tǒng)的破壞。

2.4 黑體紅外輻射解離(blackbody infrared radioactive dissociation，BIRD)

BIRD是從熱解離技術(shù)中發(fā)展起來的、主要應(yīng)用于FT ICR質(zhì)譜儀器的氣相離子解離技術(shù)[35-36]。它與IRMPD技術(shù)相類似，也是通過低能紅外光子的多次吸收來解離，它們的區(qū)別主要在于輻射源不同。BIRD是利用熱電偶探測溫度變化，對處在高真空條件下的分析池進行加熱，池壁產(chǎn)生黑體紅外光子。BIRD實驗的溫度變化范圍一般是從室溫到約250℃，是一個慢熱過程，解離反應(yīng)一般會持續(xù)幾秒甚至幾分鐘。在BIRD實驗之前經(jīng)常會利用短脈沖的惰性浴氣體，與選定的母離子發(fā)生碰撞對母離子冷卻，以免其與背景中的中性分子發(fā)生隨機碰撞導(dǎo)致碰撞誘導(dǎo)解離發(fā)生。對于大分子離子，在BIRD實驗初期，離子與池壁輻射的紅外光子不斷進行著能量的交換，內(nèi)能得到積累，此時離子吸收和輻射光子的速率要遠大于解離速率，離子的內(nèi)能按照玻爾茲曼分布規(guī)律達到平衡。當該誘導(dǎo)期結(jié)束后，母離子的內(nèi)能通常會呈現(xiàn)指數(shù)式衰減，同時相應(yīng)的碎片離子產(chǎn)生。離子的解離速率及裂解途徑與分析池溫度直接相關(guān)。相比其他解離技術(shù)，BIRD技術(shù)更容易獲得精確的解離能和離子解離的動態(tài)信息。

2.5 電子捕獲解離(electron capture dissociation，ECD)

ECD是由McLafferty小組在1998年發(fā)明的針對FT ICR質(zhì)譜的裂解技術(shù)，主要用于多肽和蛋白質(zhì)的分析[37-38]。它通常是將電噴霧所產(chǎn)生的帶有多電荷的離子引入到FT ICR分析池中，離子與分析池后的陰極發(fā)射裝置發(fā)射的電子(一般<1eV)相遇，電子被正離子捕獲，離子發(fā)生裂解。與CID、IRMPD和BIRD等斷裂總是發(fā)生在能量最低的化學(xué)鍵產(chǎn)生b、y系列離子不同，ECD是由低能量的自由電子與質(zhì)子化的多電荷離子在相互作用的過程中由于放熱而瞬間產(chǎn)生碎裂，它是一個非各態(tài)歷經(jīng)(non-ergodic)的過程，斷裂反應(yīng)先于分子內(nèi)振動能量重新分布進行，主要產(chǎn)生由N—Cα鍵的斷裂而形成的c、z系列離子。ECD技術(shù)適合于氨基酸序列長度較長的、帶3個或3個以上電荷為主的肽段解離。它對蛋白質(zhì)和多肽的主鏈斷裂沒有歧視，裂解覆蓋程度高，翻譯后修飾基團不會丟失，優(yōu)先斷裂二硫鍵。ECD的這些技術(shù)優(yōu)勢與以往解離方法在數(shù)據(jù)上有很好的互補性，在對蛋白翻譯后修飾研究和利用“Top down”策略對蛋白質(zhì)序列分析方面有著廣闊的應(yīng)用前景。不過，ECD不能使非共價鍵斷開，這就阻礙了其對高相對分子質(zhì)量蛋白的斷裂，尤其是對于20kDa以上的蛋白質(zhì)，常規(guī)ECD的斷裂作用就微乎其微了。為了突破該限制，對常規(guī)ECD技術(shù)進行了改進，如活化離子ECD技術(shù)，在ECD前使用氮氣脈沖(或紅外照射、黑體輻射等)對大相對分子質(zhì)量的母離子進行碰撞，使離子在電子捕獲前高級結(jié)構(gòu)被破壞。采用紅外照射活化ECD方法已經(jīng)實現(xiàn)了對45kDa蛋白質(zhì)的鑒定[38]。另外，單電荷母離子捕獲電子后會中和而不顯電性,無法使用ECD分析。此外，靈敏度不高也是ECD技術(shù)需要改進的方面。

3 近年來FT ICR MS在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用

3.1 在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

高性能FT ICR MS能夠準確測定蛋白質(zhì)中多肽鏈的數(shù)目和各肽段的氨基酸序列，有效提高鑒定的速度和可信度；與多維色譜聯(lián)用能夠高效精準地進行鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)研究；還能夠用Top down途徑分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾。而如今，在蛋白質(zhì)組學(xué)中，質(zhì)譜技術(shù)更適合于高通量的蛋白組測定，快速完整地獲得蛋白質(zhì)的氨基酸信息是生物質(zhì)譜發(fā)展的方向。Ge Ying等用電子捕獲解離技術(shù)(ECD)成功地對大腸桿菌的細胞抽提物中催化維生素B1生物合成的幾種酶進行了二硫鍵的全面結(jié)構(gòu)鑒定，此技術(shù)提高了蛋白質(zhì)組學(xué)中大的蛋白質(zhì)的細節(jié)結(jié)構(gòu)鑒定[39]。2014年，Lakshmanan等在液相色譜聯(lián)用FT ICR MS上采用獨立數(shù)據(jù)碎片方法對自上而下的蛋白質(zhì)水解酶蛋白進行識別[40]。另外，研究蛋白質(zhì)與其他生命物質(zhì)的復(fù)合物也具有重要意義。Nousiainen等以SORI-CID和電噴霧FT ICR MS研究了鈣調(diào)蛋白RS20-Ca4復(fù)合物的氣相解離，一定程度上揭示了復(fù)合物中非共價相互作用的主要來源[41]。

3.2 在代謝組學(xué)以及中藥現(xiàn)代化研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是通過比較對照組和實驗組的代謝組(metabolomes，某一生物的所有代謝物組分)，以尋找代謝譜差異的研究，是研究生物體內(nèi)的小分子代謝物質(zhì)變化規(guī)律的科學(xué)。它是功能基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要組成部分，也是生命科學(xué)內(nèi)繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新發(fā)展起來的一種組學(xué)。普遍認為，如果能把蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)整合在一起，將能破譯基因的功能和闡明基因的活動規(guī)律，也就能獲得生命有機體生物學(xué)更完整的圖像。對代謝組學(xué)而言，傅里葉變換質(zhì)譜由于其高分辨率和高準確度等特點，可以不采用色譜分離，便能直接進行代謝物的檢測和鑒定。2012年，Konstantinos等利用FT ICR MS和氣相色譜的聯(lián)用，研究出關(guān)于馬鈴薯的病原體入侵時的一套完整的代謝網(wǎng)絡(luò)[42]。2014年，Sadakatali等利用FT ICR質(zhì)譜圖研究了硫醇的代謝物并量化分析了細胞谷胱甘肽[43]。

另一方面，高分辨質(zhì)譜由于具有質(zhì)量范圍寬、掃描速度快、靈敏度高的優(yōu)點，可提供母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)及可能的元素組成，因此在中藥化學(xué)成分的快速鑒定中得到廣泛的應(yīng)用。在中藥及其復(fù)方的定性和定量研究中，高分辨質(zhì)譜起著重要的作用，其分析結(jié)果為全面了解中藥及其復(fù)方的有效成分和藥理學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。劉春明等[44]利用FT ICR MS高分辨質(zhì)譜以及其他一些技術(shù)手段，對朝鮮淫羊藿中生物堿類進行分析及鑒定，并發(fā)現(xiàn)了一種新的生物堿。2014年，左冉等為了深入研究黃連解毒湯體內(nèi)發(fā)揮療效的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)，用液相色譜聯(lián)用FT ICR MS方法發(fā)現(xiàn)并確證了給予黃連解毒湯后大鼠血漿中主要的38個入血成分[45]。隨著FT ICR MS的廣泛應(yīng)用于中藥的分析和鑒定，必將為我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)事業(yè)做出巨大的貢獻，也將有利于推動中醫(yī)藥向世界的進一步推廣。

4 展望

首臺FT ICR MS問世至今已40年。隨著電子技術(shù)、軟件技術(shù)以及離子化方法的發(fā)展，近年來FT ICR在性能高端化、易操作化、多功能化等方面有了很大的發(fā)展。同時，生命科學(xué)的快速發(fā)展對高分辨質(zhì)譜又提出了更新、更高的要求。展望未來，F(xiàn)T ICR MS仍有較大的發(fā)展空間，主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

4.1 對超導(dǎo)磁體提出了更高的要求

超導(dǎo)磁體是FT ICR的核心部件。由于更高的磁場強度不僅會大幅度提高其質(zhì)譜分辨率和降低測量誤差，而且也能擴展其測量范圍。追求超高磁場來適應(yīng)其在相關(guān)科研領(lǐng)域的發(fā)展是其最重要的一個發(fā)展方向。當前大多數(shù)實驗室FT ICR配備的超導(dǎo)磁體為7T、9.4T 或 12T、14.5T 與15T高性能儀器目前已經(jīng)在一些實驗室開始使用，21T(相當于核磁900M)系統(tǒng)目前已經(jīng)建成。 但另一方面，超導(dǎo)磁體的高額成本及維護成本卻限制了其在各個領(lǐng)域，尤其是作為常規(guī)分析儀器推廣。其中一個非常強的競爭對手即為Orbitrap質(zhì)譜儀[13,46]。Orbitrap采用靜電場軌道阱作為離子回旋振蕩的質(zhì)量分析器(圖1f)，它通過探測離子的鏡像電流，并將時間域信號轉(zhuǎn)化為頻率域信號，進而得到質(zhì)譜圖。盡管在分辨率等指標方面，Orbitrap稍遜一些，但是其價格相對便宜，體積小了很多，使用和維護也更為方便。Orbitrap作為一個輕量級的FT MS，可以滿足大多數(shù)高分辨率質(zhì)譜實驗的要求，已受到越來越多的用戶青睞。為面對這一挑戰(zhàn)，F(xiàn)T ICR MS除了在進一步提高自身的高端品質(zhì)外，也更加重視采用新技術(shù)來降低其運行成本。一個典型的例子就是目前FT ICR的超導(dǎo)磁體一般多采用一個超低溫泵將揮發(fā)出來的氣體氦重新壓縮成液氦注入到磁體當中，以減少液氦的充裝次數(shù)，提高儀器運行的經(jīng)濟性和環(huán)保性。

4.2 更豐富的串聯(lián)質(zhì)譜功能

現(xiàn)在的FT ICR儀器除具有傳統(tǒng)的時間串聯(lián)質(zhì)譜功能(如SORI-CID，IRMPD與ECD等)外，多在離子源后串聯(lián)一個四級桿質(zhì)量分析器和一個六級桿碰撞池(quadrupole和hexapole，Qh)或者線性離子阱組成混合型傅里葉變換質(zhì)譜，使其具有類似于三重四級桿或Q-TOF質(zhì)譜儀的Qh CID串聯(lián)質(zhì)譜功能。利用混合型FT ICR進行二級質(zhì)譜分析，碎片在Qh區(qū)域或線性離子阱內(nèi)產(chǎn)生，高分辨探測在FT ICR池中進行，這比在分析池中做傳統(tǒng)的時間串聯(lián)分析簡單快捷，同時也大大提高了二級質(zhì)譜的分析速度，解決了其與液相色譜聯(lián)用兼容性較差的技術(shù)難題。此外，雜合Qh可富集低豐度目標離子極大提高了微量關(guān)鍵樣品的檢測能力。正是因為這一技術(shù)革新，使FT ICR解決復(fù)雜樣品和進行復(fù)雜實驗的能力大大提高，特別適用于生命科學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的精細研究，擴展了它在生命科學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域。

4.3 更豐富的離子源

目前，F(xiàn)T ICR能夠兼容各種類型的離子源并與多種傳統(tǒng)或獨特的解析方法相結(jié)合，可提供最大的實驗靈活性。除了ESI與MALDI這兩種最常用的離子化方式，它可以選擇搭配大氣壓化學(xué)電離(APCI)，大氣壓光電離(APPI)和納噴霧(nanoESI)等多種電離方式。另外，如Bruker推出的復(fù)合離子源，通過電腦控制可以輕松完成ESI與MALDI之間的切換，而且兩個源不僅可以單獨使用，還可以同時使用，這在為用戶提供應(yīng)用便利的同時也提供了新的實驗?zāi)芰Α６陙戆l(fā)展起來的常壓離子化技術(shù)，如電噴霧解吸電離技術(shù)(DESI)[47]，實時直接分析電離技術(shù)(DART)[48]和基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離技術(shù)(MALDESI)[49]等，可將復(fù)雜樣品直接離子化或者只需對樣品做簡單的預(yù)處理。常壓離子化技術(shù)與FT ICR聯(lián)用，為FT ICR對復(fù)雜體系樣品同時分析提供了新的思路，使其應(yīng)用領(lǐng)域得到進一步拓展。

4.4 綜合性能更強

性能高端化與應(yīng)用功能多元化是FT ICR發(fā)展的一個方向。以Bruker的最新型SolariX XR為例：Apollo Ⅱ離子漏斗電噴霧源能夠在寬質(zhì)量范圍提供高的離子傳輸效率；優(yōu)化的離子透鏡系統(tǒng)提供了更寬質(zhì)量范圍和更高靈敏度；偏軸離子捕集技術(shù)減少了離子飛行帶來的質(zhì)量歧視效應(yīng)，提高了儀器的掃描速度、質(zhì)量范圍和靈敏度；而最新采用的和諧阱技術(shù)[28]，可提供全范圍離子的穩(wěn)定性和高達數(shù)千萬的分辨率，可以對化合物同位素精細結(jié)構(gòu)進行深入分析，揭開之前遺漏的信息。因此，此類儀器將可以應(yīng)用在其它類型質(zhì)譜難以解決的高端應(yīng)用領(lǐng)域，包括生物大分子精細分析、小分子組織分子成像、代謝組學(xué)分析、石油組學(xué)和食品、飲料、尿液、環(huán)境等復(fù)雜體系分析、未知物定性定量分析等。

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FourierTransformIonCyclotronResonanceMassSpectrometer：Past,PresentandFuture*

Li Shuqi Bao Xiaodi Yin Hong Kong Xianglei* *

(StateKeyLaboratoryofElemento-OrganicChemistry,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

The history and development of Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer (FT ICR MS) is presented in detail. The dissociation technique for tandem mass spectrometry and the latest application are introduced. The development trend of FT ICR MS is discussed.

Fourier transform mass spectrometry; Ion cyclotron resonance; High resolution mass spectrometry; Tandem mass spectrometry; Superconducting magnet

10.3866/pku.DXHX20150401

國家自然科學(xué)基金(Nos.21172121,21121002,21475065)

**通訊聯(lián)系人，E-mail:kongxianglei@nankai.edu.cn

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