濟瀆紅蒜莖尖脫毒快繁培養(yǎng)技術(shù)研究

陳麗，趙玉玲，張慶社，田瑞昌，陳坤，葛佳文，牛小沛，馬朝喜

（河南濟源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，459000）

大蒜作為一種特殊蔬菜，不僅含有豐富的維生素、氨基酸、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分，而且含有特殊的抗菌、抗癌等活性物質(zhì)，被認為是重要的天然保健品[1，2]。濟瀆紅蒜是濟源市地方特色品種，味道辛辣鮮美、蒜薹短粗肥嫩無梗絲、蒜泥味道長久，其獨特的品質(zhì)深受濟源人喜愛。濟瀆紅蒜蒜皮紫紅透明、光澤喜人，在清朝時作為貢品，只有皇族才能享用，因此又被稱為“濟瀆金蒜”。近年來，由于病毒病的為害，我國大蒜種性普遍退化、單產(chǎn)降低、品質(zhì)變劣，一些名優(yōu)特種大蒜因受病毒病為害幾乎瀕于絕種[3，4]。本試驗以濟瀆紅蒜為材料，以期篩選出適合其脫毒快繁的培養(yǎng)基，建立一套適宜濟源市名優(yōu)大蒜地方品種脫毒快繁的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

濟瀆紅蒜，由濟源市農(nóng)科院種植培育。

1.2 試驗方法

①剝離莖尖時間的篩選 2014年5月底收獲濟瀆紅蒜，從收獲初開始，每月進行1～2次莖尖剝離試驗。

②外植體處理 選擇生長良好的濟瀆紅蒜流水沖洗5 h，用洗潔精沖洗數(shù)次后，用手術(shù)刀片切除2/3留基部備用。無菌操作下75%酒精消毒35 s→無菌水沖洗1次→0.1%氯化汞滅菌10 min→無菌水沖洗8次進行材料表面滅菌。然后用無菌濾紙吸干水分，在顯微鏡下剝離莖尖，莖尖長度為0.2～0.6 mm，以備接種。

③愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方的篩選 以1/2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)6-BA、2，4-D、NAA 3個因素，每個因素3個水平，詳見表1，共9個處理，詳見表2，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)基pH值6.0、蔗糖濃度為30%、瓊脂粉含量3 g/L。將剝離好的莖尖接種在不同培養(yǎng)基上，散射光光照強度2 000～3 000 lx、溫度（25±2）℃、光照時間 12 h/d進行培養(yǎng)。

④分化增殖培養(yǎng)基的篩選 以1/2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的 6-BA、NAA、2，4-D，共6個處理，詳見表3，每處理4次重復(fù)；培養(yǎng)基pH值6.0、蔗糖濃度30%、瓊脂粉含量3 g/L。將誘導(dǎo)的愈傷組織接種在不同培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同③。

⑤生根培養(yǎng)基的篩選和移栽 以1/2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度6-BA、NAA，詳見表4，共4個處理；將增殖濟瀆紅蒜苗接種于生根培養(yǎng)基上，觀察生根情況；培養(yǎng)條件同③。將生根后的脫毒苗，移栽到已滅菌的草炭∶蛭石=2∶1的穴盤中。移栽后覆蓋遮陽網(wǎng)防曬、防蟲網(wǎng)防蚜蟲。

⑥大蒜內(nèi)病毒的檢測 將剝離的大蒜莖尖培養(yǎng)2個月后，取部分愈傷或小苗搗碎、研磨，制成組織汁液，用磷酸鹽緩沖液在3 000 r/min離心20 min后，在電鏡下觀察，并以未脫毒的樣品作對照，確認含病毒的基本形態(tài)和特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間對濟瀆紅蒜莖尖剝離的影響

根據(jù)每月剝離的情況發(fā)現(xiàn)，每年的5月底到翌年2月底，莖尖容易剝離，并且8～10月剝離的莖尖誘導(dǎo)成活率高于其他時間。因為初期剝離的莖尖，莖尖含水量大，剝離過程中易破碎；而后期，莖尖較小，不易剝離。

表1 試驗設(shè)計 mg/L

表2 濟瀆紅蒜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

表3 濟瀆紅蒜分化增殖培養(yǎng)基的篩選

2.2 濟瀆紅蒜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

為了促進莖尖成活以及分化，需選擇合適的激素配比。試驗觀察發(fā)現(xiàn)，如果在接種后14 d，莖尖出現(xiàn)透明狀，說明在誘導(dǎo)愈傷過程中出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，且培養(yǎng)基濕度大；接種20 d后，莖尖泛綠色，并且膨大，說明開始誘導(dǎo)愈傷。正常的愈傷組織是黃綠色，且結(jié)構(gòu)較為緊密，這種愈傷組織分生能力強，芽點較多；若為深綠色，則太硬不易分化，且最后容易轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色而死亡。由表2可知，1/2 MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.8 mg/L的培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率較高，但愈傷組織呈淺黃色，不分化、不成塊，在培養(yǎng)過程中逐漸玻璃化死亡。因此，最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 1.8 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

2.3 濟瀆紅蒜分化增殖培養(yǎng)基的篩選

選擇較好的愈傷組織進行分化增殖培養(yǎng)，在激素濃度較高的條件下，誘導(dǎo)增殖率會降低，主要表現(xiàn)為形成畸形苗、葉片較長，芽尖生長較慢；有些會出現(xiàn)芽點較多、較綠，而分化比較少的情況。從表3可以看出，1/2 MS+6-BA 2.6 mg/L+2，4－D 0.3 mg/L+NAA 1.5 mg/L，增殖系數(shù)可達4倍，出苗比較整齊，分化苗生長比較健壯。

表4 濟瀆紅蒜愈傷組織的繼代培養(yǎng)情況

2.4 濟瀆紅蒜生根培養(yǎng)基的篩選

從表4可以看出，1/2 MS+6-BA 2.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L，生根效果最好。6-BA濃度為2.2 mg/L的培養(yǎng)基中，生根少且較慢，出現(xiàn)根部膨大的現(xiàn)象，影響移栽成活率。

2.5 病毒檢測結(jié)果

隨機取再生大蒜幼苗50株，用未經(jīng)脫毒的大蒜幼苗作對照，進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照100%含病毒，且病毒含量很高；而再生的大蒜幼苗有68%不含病毒，即脫去病毒；15%的病毒含量高，但仍低于對照。說明莖尖剝離脫毒可降低病毒含量。

3 討論與結(jié)論

有資料顯示，切取蒜瓣內(nèi)幼芽的莖尖分生組織，經(jīng)組織培養(yǎng)獲得脫毒苗是解決大蒜品種退化、提高大蒜產(chǎn)量和質(zhì)量的有效途徑[5～7]。莖尖剝離過程中，其大小直接影響脫毒效果及成活率。試驗中發(fā)現(xiàn)，0.3～0.5 mm長的莖尖有利于提高成活率并且脫毒效果比較明顯；雖然0.1～0.2 mm的莖尖脫毒效果最好，但是接種后成活率不高；而莖尖長度低于0.4 mm時，誘導(dǎo)愈傷時玻璃化現(xiàn)象嚴重，原因有待進一步分析。但在脫毒過程中，完全脫毒的成功率還不是很高，下一步需要改進脫毒方法。

[1]管正學(xué)，王建立，張學(xué)予.我國大蒜資源及其開發(fā)利用研究[J].自然資源，1994（5）：54-59.

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