KAI1/CD82和β-環(huán)連蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相互關(guān)系*

王連渠，卜宏民，閆擁軍，車新平，徐國良，焦志靈，張二軍

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 開封 475001）

·論著·

KAI1/CD82和β-環(huán)連蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相互關(guān)系*

王連渠，卜宏民，閆擁軍，車新平，徐國良，焦志靈，張二軍

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 開封 475001）

目的探討KAI1/CD82和β-環(huán)連蛋白（β-catenin）蛋白在腎透明細(xì)胞癌（RCCC）組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法對91例腎透明細(xì)胞癌和30例正常腎組織進(jìn)行KAI1/CD82和β-catenin蛋白檢測。結(jié)果RCCC組織中，KAI1/CD82和β-catenin蛋白異常表達(dá)率分別為46.2%（42/91）和54.9%（50/91），且兩者之間的表達(dá)具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。β-catenin蛋白的異常表達(dá)與RCCC的病理學(xué)分級、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜0.05）。KAI1/CD82的表達(dá)在侵襲轉(zhuǎn)移組和非侵襲轉(zhuǎn)移組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），和病理分級無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論KAI1/CD82蛋白異常表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，而β-catenin異常表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌是分化、惡性程度有關(guān)，故對其檢測有助于對腎透明細(xì)胞癌診斷和治療進(jìn)行全面的評估。

KAI1/CD82；β-環(huán)連蛋白；腎透明細(xì)胞癌；免疫組織化學(xué)

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）簡稱為腎癌，是惡性程度較高的腫瘤，起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)。調(diào)查結(jié)果表明，腎癌僅次于膀胱腫瘤，在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中占第二位，其中，透明細(xì)胞癌（renal clear cell carcinoma，RCCC）較常見，占全部腎癌的70%左右[1]。臨床上患者往往預(yù)后不良主要與腫瘤的侵襲性生長及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。因此，深入探討腎癌浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制，可以為臨床工作提供寶貴的借鑒價值。近年來研究表明，腫瘤細(xì)胞表面黏附性改變與腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而β-環(huán)連蛋白（β-catenin）是細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。另外，KAI1基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，對多種腫瘤的惡性進(jìn)程有抑制作用。KAI1基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物為CD82，是四穿膜超家族（transmembrance-4 super-family，TM4SH）成員[3]。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測KAI1和β-catenin在RCCC中的表達(dá)，初步探討其在RCCC臨床分期及惡性程度判斷中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1收集標(biāo)本

臨床資料來源于我院泌尿外科2012年10月-2014年2月腎透明細(xì)胞癌石蠟樣標(biāo)本91例。年齡40～68歲，中位年齡47歲；依照中國泌尿外科疾病診斷治療指南（2009年），腫瘤分級[按照WHO推薦Fuhrman分級標(biāo)準(zhǔn)（1997年）]：Fuhrman I～I(xiàn)I級（高分化）49例，F(xiàn)uhrman III級（中分化）20例，F(xiàn)uhrman IV級（低分化或未分化）22例；無淋巴轉(zhuǎn)移者68例，出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者23例。對照組為30例同期因腎外傷作腎切除的正常腎組織。其中，男16例，女14例；年齡7～66歲，中位年齡38歲。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診，且有完整的臨床和病理資料。

1.2檢測方法

手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)過常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋之后石蠟切片機(jī)制成6～8μm的切片，并將切片放入60～65℃水中展平，然后將其轉(zhuǎn)移到涂過多聚賴氨酸的載玻片。將石蠟切片進(jìn)行PAS染色和免疫組織化學(xué)SP染色。所用的一抗：濃縮型鼠抗人KAI1/CD82單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）和β-catenin鼠抗人單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。免疫組織化學(xué)SP試劑盒和DAB顯色試劑均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3結(jié)果判定

由2位病理學(xué)醫(yī)師在不知臨床病理資料的情況下對免疫組織化學(xué)的結(jié)果進(jìn)行評估，在顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選擇5個視野，40×10高倍顯微鏡下觀察計數(shù)100個瘤細(xì)胞。KAI1/CD82陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜棕黃色；β-catenin陽性信號位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。評分標(biāo)準(zhǔn)[4]采用3個參數(shù)的半定量積分方法：即染色強(qiáng)度（A）、陽性細(xì)胞數(shù)（B）和兩者計分的乘積。完全不染色、淺棕黃色、棕黃色及深棕黃色分別賦值為0、1、2及3分；陽性細(xì)胞百分比0%～24%、25%～49%、50%～74%和75%～100%分別賦值為1、2、3及4分，兩者相乘為陽性得分。兩者計分乘積，0分為陰性（-）、1～4分為弱陽性（+）、5～8分為中度陽性（++）、9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。（++～+++）計為陽性率或異常表達(dá)率；（-～+）計為陰性率及正常表達(dá)率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗及Spearman等級相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1正常腎臟和腎透明細(xì)胞癌HE染色形態(tài)

正常腎臟（圖1A）光鏡下可見：腎小球由血管球和腎小囊組成。腎透明細(xì)胞癌（圖1B）光鏡下可見：腫瘤細(xì)胞圓形或多邊形，排列呈實性，有寬廣的透明細(xì)胞質(zhì)，含豐富糖原和類脂。間質(zhì)不多，含豐富的毛細(xì)血管和血竇。

2.2KAI1/CD82在正常腎組織和腎透明細(xì)胞癌組織的表達(dá)

KAI1/CD82主要在細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞膜表達(dá)，見圖2。RCCC組織中，KAI1/CD82陽性表達(dá)率為46.2%（42/91）；在30例正常腎組織中的陽性表達(dá)率為73.3%（22/30），對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行量化分析表明：兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1，χ2=6.69，P＜0.05。

2.3β-catenin在正常腎組織和腎透明細(xì)胞癌組織的表達(dá)

β-catenin正常腎小管上皮胞質(zhì)低表達(dá)或不表達(dá)（圖3A），在30例正常腎組織中的陽性表達(dá)率為6.7%（2/30）；在RCCC中胞質(zhì)高表達(dá)或蓄積（圖3B），β-catenin陽性表達(dá)率為54.9%（50/91）；對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行量化分析表明：兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2，χ2=21.46，P＜0.05。

2.4 KAI1/CD82和β-catenin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

研究結(jié)果顯示，RCCC組織中KAI1/CD82的異常表達(dá)在侵襲轉(zhuǎn)移組和非侵襲轉(zhuǎn)移組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），和病理分期無關(guān)（P＞0.05）；β-catenin蛋白的異常表達(dá)與RCCC的病理學(xué)分級、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見表3和4。

2.5KAI1/CD82和β-catenin在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相互關(guān)系

研究結(jié)果顯示，在91例腎透明細(xì)胞癌組織中KAI1/CD82和β-catenin均陰性表達(dá)的有11例，均陽性表達(dá)的有12例，KAI1/CD82陽性表達(dá)β-catenin陰性表達(dá)者30例，而KAI1/CD82陰性表達(dá)β-catenin陽性表達(dá)者38例。統(tǒng)計學(xué)分析顯示兩者呈負(fù)相關(guān)。見表5，r=-0.491，P＜0.05。

圖1 正常腎與腎透明細(xì)胞癌的結(jié)構(gòu)比較（HE染色，×200）

圖2 正常腎組織和腎透明細(xì)胞癌KAI1/CD82的陽性表達(dá)（免疫組織化學(xué)，×200）

圖3 正常腎組織和腎透明細(xì)胞癌β-catenin的表達(dá)比較（免疫組織化學(xué)，×400）

表1 兩組KAI1/CD82蛋白陽性表達(dá)率的比較例（%）

表2 兩組β-catenin蛋白陽性表達(dá)率的比較例（%）

表3 KAI1/CD82表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系例（%）

表4 β-catenin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系例（%）

表5 在子宮內(nèi)膜癌組織中KAI1/CD82和β-catenin的表達(dá)相關(guān)性分析例

3 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，與腦血管疾病、糖尿病并列為人類的“三大殺手”[5]。腎透明細(xì)胞癌是常見的泌尿系惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐漸上升。在人類探索腫瘤的曲折道路中，頗受關(guān)注的、同腫瘤發(fā)生發(fā)展最為密切的是腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制。臨床上絕大多數(shù)的惡性腫瘤患者，最終是因為腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡，而很少一部分是死于原發(fā)癌。腫瘤的惡性生物學(xué)行為是一個多基因參與的，通過不同基因不同時相的差異表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜過程[6]。目前，根據(jù)眾多學(xué)者對惡性腫瘤的長期研究發(fā)現(xiàn)，其呈浸潤性生長和轉(zhuǎn)移是最難攻破的障礙，如何快速的找到一個有效指標(biāo)，在腫瘤尚未轉(zhuǎn)移之前準(zhǔn)確評價腫瘤侵襲力與轉(zhuǎn)移潛能，是腫瘤防治中一個重要的課題。

KAI 1基因（Kang Ai 1）是1955年DONG等從轉(zhuǎn)移到AT6.1細(xì)胞系中的人第11號染色體中分離到的能特異性抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的基因。DNA序列分析證明KAI1與CD82基因是相同的。KAI1/CD82屬于TM4SF成員之一，這是一類結(jié)構(gòu)和功能都非常相似的細(xì)胞膜糖蛋白，擁有4個跨膜區(qū)，跨膜區(qū)上有些高度保守的具有極性的氨基酸，TM4SF在細(xì)胞的聚集、黏附、遷移和增殖中均有調(diào)節(jié)作用，其影響部分與TM4SF調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附有關(guān)[7]。KAI1/CD82屬于惡性基因的負(fù)性調(diào)節(jié)基因，與人類許多惡性腫瘤關(guān)系密切，如CD82在前列腺癌、肺癌及膀胱癌等中表達(dá)下調(diào)[8-10]；在食道鱗形細(xì)胞癌原發(fā)灶和淋巴轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義[11]。這些研究結(jié)果都顯示，KAI1/CD82在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示，在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌組織中KAI1/CD82的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示腎透明細(xì)胞癌在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中伴隨著KAI1/CD82表達(dá)的下降，KAI1/CD82的表達(dá)可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個指標(biāo)。

β-catenin是Wnt信號通路中重要的下游信號分子，在細(xì)胞中存在轉(zhuǎn)位，可以從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)的Tcf轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)Wnt相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖的調(diào)控促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[12]。當(dāng)Wnt通路被抑制時，β-catenin被GSK3β和CKI等激酶磷酸化，導(dǎo)致其降解而不在核內(nèi)聚集。Wnt可與LDL受體相關(guān)蛋白結(jié)合，抑制β-catenin降解，使其穩(wěn)定表達(dá)并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與Tcf轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。較多的研究表明，β-catenin基因突變或功能異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞彌散甚至浸潤[13]。并且是引起Wnt通路活化、β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)集聚，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖的常見原因。β-catenin作為Wnt通路的核心蛋白，其在核內(nèi)聚積及其功能的激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。研究者在結(jié)直腸癌細(xì)胞中對Wnt/β-catenin信號通路下游的靶基因（c-Myc、cyclin-D1、MMP7、survivin及生長因子等）進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)β-catenin/Tcf轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體的上調(diào)或者β-catenin核集聚等原因可引起靶基因的活化從而抑制細(xì)胞的正常分化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)：腎透明細(xì)胞癌組β-catenin的陽性表達(dá)顯著高于正常腎組織組，β-catenin在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)和病理分期、肌層侵潤和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著子腎透明細(xì)胞癌分期的增加β-catenin表達(dá)的陽性率逐漸上升，結(jié)果表示β-catenin在腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展中發(fā)揮著作用，并且隨腎透明細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的增加β-catenin的作用也漸漸加強(qiáng)，伴隨著腎透明細(xì)胞癌在深肌層的侵潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移β-catenin的表達(dá)也逐漸升高，提示：β-catenin陽性表達(dá)的惡性腫瘤的侵襲力和轉(zhuǎn)移能力更加強(qiáng)大。

最近的研究顯示KAI1/CD82在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)與β-catenin相關(guān)[16]，β-catenin可以和reptin染色質(zhì)重塑，進(jìn)而形成β-catenin-reptin復(fù)合體，代替轉(zhuǎn)錄激活輔助因子Tip60復(fù)合體，直接和錨定于KAI1/CD82啟動子上的NFκBp50亞基結(jié)合[17]。結(jié)果顯示：HDAC3復(fù)合體等轉(zhuǎn)錄抑制輔助因子和β-catenin-reptin復(fù)合體結(jié)合會抑制KAI1/CD82的轉(zhuǎn)錄。LIU等[18]也認(rèn)為：KAI1/CD82在具有侵襲性腫瘤中的低表達(dá)與β-catenin有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：腎透明細(xì)胞癌組織中KAI1/CD82表達(dá)與β-catenin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，對KAI1/CD82和β-catenin檢測有助于對腎透明細(xì)胞癌診斷和治療進(jìn)行全面的評估。

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（王榮兵 編輯）

Expression of KAI1/CD82 and β-catenin and its relationship with renal clear cell carcinoma*

Lian-qu WANG,Hong-min BU,Yong-jun YAN,Xin-ping CHE, Guo-liang XU,Zhi-ling JIAO,Er-jun ZHANG
(Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng,Henan 475001,P.R.China)

【Objective】To detect the expression of KAI1/CD82 and β-catenin protein in renal clear cell carcinoma(RCCC),and investigate the relation between it and RCCC development.【Methods】Immunohistochemical SP method(streptavidin-perosidase)was used to detect KAI1/CD82,β-catenin protein for 91 cases of RCCC and 30 cases of normal renal tissue.【Results】In RCCC group,the abnormal expression rates of KAI1/CD82 and β-catenin protein were respectively 46.2%(42/91)and 54.9%(50/91),and the expression of them was correlated with each other(P＜0.05).The abnormal expression of β-catenin protein was associated with RCCC pathological grade, myometrial invasion and lymph node metastasis(P＜0.05).The difference in the expression of KAI1/CD82 between invasion-metastasis group and non-invasion-metastasis group was statistically significant(P＜0.05),but KAI1/CD82 expression was not related with pathological grading(P＞0.05).【Conclusion】The abnormal expression of KAI1/ CD82 was associated with metastasis of RCCC,whereas β-catenin expression was associated with differentiation and malignancy degree of RCCC,and therefore their detection was contributed to comprehensive assessment of RCCC diagnosis and treatment.

KAI1/CD82;β-catenin;renal clear cell carcinoma;immunohistochemistry

R737.11

A

1005-8982（2015）25-0045-05

2015-05-21

河南省科技發(fā)展計劃項目（No：112300410077）