七氟醚預(yù)處理對(duì)脊髓缺血再灌注大鼠5脂氧合酶表達(dá)的影響*

歐軍，趙紅，謝紅，姚平波，蘇小桃，何軍，何俊

（1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院脊椎外科，湖南 衡陽(yáng) 421002；2.南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院基礎(chǔ)護(hù)理教研室，湖南，衡陽(yáng) 421001）

·論著·

七氟醚預(yù)處理對(duì)脊髓缺血再灌注大鼠5脂氧合酶表達(dá)的影響*

歐軍1，趙紅2，謝紅1，姚平波1，蘇小桃1，何軍1，何俊1

（1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院脊椎外科，湖南 衡陽(yáng) 421002；2.南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院基礎(chǔ)護(hù)理教研室，湖南，衡陽(yáng) 421001）

目的探討七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷時(shí)5脂氧合酶（5-LOX）表達(dá)的影響。方法雄性成年SD大鼠45只，體重250～300 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為3組（n=15）：假手術(shù)組（S組）、脊髓缺血再灌注組（I/R組）和七氟醚預(yù)處理組（I組）。采用胸主動(dòng)脈球囊阻斷+體循環(huán)低血壓法制備大鼠脊髓缺血再灌注模型。I組吸入3.4%七氟醚2 h，24 h后制備模型。于再灌注24 h時(shí)采用神經(jīng)功能缺陷評(píng)分（NDS）法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能，隨后處死取脊髓，分別采用Western blot法和RT-PCR法測(cè)定5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白及其mRNA的表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。結(jié)果與S組比較，I/R組和I組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分升高，I/R組5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)，TNF-α含量升高，I組5-LOX mRNA和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與I/R組比05）。結(jié)論七氟醚預(yù)處理可能通過(guò)下調(diào)5-LOX表達(dá)，抑制ERK1/2信號(hào)通路，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

生四烯酸鹽5-脂氧合酶；七氟醚；缺血預(yù)處理；再灌注損傷；脊髓

研究表明脊髓缺血再灌注損傷與炎癥因子的釋放、細(xì)胞內(nèi)外離子紊亂、自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化、興奮性氨基酸及細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)等密切相關(guān)。因此，針對(duì)脊髓再灌注損傷中神經(jīng)細(xì)胞靶向藥物治療是挽救脊髓功能的關(guān)鍵點(diǎn)。與此同時(shí)，脊髓缺血再灌注損傷在嚴(yán)重創(chuàng)傷或術(shù)中發(fā)生出血性休克患者的臨床病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。因此，此類(lèi)手術(shù)的麻醉藥選擇除了能達(dá)到滿(mǎn)意的麻醉療效外，還應(yīng)具有脊髓保護(hù)作用[1-3]。七氟醚作為吸入性臨床常用的麻醉藥，在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究均表明，七氟醚預(yù)處理可減輕脊髓缺血再灌注損傷[4-5]。5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）是脂類(lèi)信號(hào)分子生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，參與了脊髓缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程[6-8]。七氟醚預(yù)處理減輕脊髓缺血再灌注損傷的機(jī)制是否與5-LOX有關(guān)尚有待研究。本研究擬探討七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注時(shí)5-LOX表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體量250～300 g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2主要試劑和儀器

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR試劑（瑞士羅氏公司），3.4%七氟醚（雅培制藥有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），蛋白提取試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司），p-ERK1/2、t-ERK1/2以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（Santa Cruz，USA），ELISA試劑盒購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組成年雄性SD大鼠45只，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為3組（n=15）：假手術(shù)組（S組）、脊髓缺血再灌注組（I/R組）和七氟醚預(yù)處理組（I組）。3組均為普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水。1.3.2小鼠脊髓缺血再灌注損傷模型的建立腹腔注射4%水合氯醛0.1 mg/kg麻醉，智能恒溫控制儀維持大鼠體溫36～37℃；大鼠在特制喉鏡直視下行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)行呼氣末正壓通氣，吸入氧濃度32%～34%，參考動(dòng)脈血?dú)馇闆r以維持pH值7.35～7.45、PaCO235～45 mmHg、PaO290～150 mmHg來(lái)調(diào)節(jié)呼吸頻率或潮氣量。采用充滿(mǎn)含肝素生理鹽水（IU/ml）的導(dǎo)管成功穿刺大鼠右頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈并分別連接有創(chuàng)動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)器，便于監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓。右股動(dòng)脈分離后，將頂端1.0～3.0 cm處有可充氣球囊的2 F微球囊導(dǎo)管從右股動(dòng)脈切開(kāi)處置入，逆行插入10.5 cm到達(dá)胸主動(dòng)脈降部。頸內(nèi)動(dòng)脈導(dǎo)管與可加熱的血液收集循環(huán)裝置連接（裝置包括一個(gè)53.0 cm含肝素生理鹽水的垂直柱）。2 F微球囊導(dǎo)管用0.05 ml的生理鹽水膨脹阻塞動(dòng)脈，當(dāng)胸主動(dòng)脈降部被阻塞的同時(shí)，開(kāi)放右頸內(nèi)動(dòng)脈，動(dòng)脈血可以回流進(jìn)入肝素化柱內(nèi)，維持前右頸內(nèi)動(dòng)脈均動(dòng)脈壓于40 mmHg，尾動(dòng)脈血壓降至6～7 mmHg時(shí)確認(rèn)動(dòng)脈阻塞完全。維持阻塞時(shí)間10 min，阻塞完成后將肝素化柱內(nèi)的血液緩慢回輸入大鼠體內(nèi)（時(shí)間＞1 min），在上述操作完成后所有大鼠均給予200 u的肝素鈉，并給予4 mg硫酸魚(yú)精蛋白，將2 F微球囊導(dǎo)管拔出，無(wú)菌外科縫合傷口，大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔除氣管導(dǎo)管回籠。

I組大鼠先進(jìn)行七氟醚預(yù)處理：自制有機(jī)玻璃箱，箱體一側(cè)靠近底部留有進(jìn)氣口，另一側(cè)靠近頂部留有出氣口。進(jìn)氣口處插入1根連接麻醉氣體揮發(fā)罐的管子并予以ULT-1工型麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)七氟醚的濃度，持續(xù)輸入含有3.4%七氟醚的氧氣，氣體流量為5 L/min；出氣口端連接ULT-1工型麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)七氟醚的濃度。在箱底放入適量鈉石灰，預(yù)充氣體，待出口氣體七氟醚濃度維持3.4%時(shí)，放入大鼠，吸入混合氣體2 h。預(yù)處理結(jié)束后24 h時(shí)制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型。

1.3.3神經(jīng)功能缺陷評(píng)分（neurological deficit scores，NDS）由2名專(zhuān)業(yè)人員（嚴(yán)格限制評(píng)分人員知曉實(shí)驗(yàn)方法及預(yù)期療效）分別獨(dú)立進(jìn)行，并于再灌注24 h時(shí)采用NDS評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)缺陷功能。Tarlov評(píng)分：0分：行走正常；1分：可行走，僅有輕度障礙；2分：后肢可支持體重，能行走1、2步；3分：不能負(fù)重，后肢活動(dòng)頻繁或有力；4分：不能負(fù)重，但后肢可見(jiàn)活動(dòng)；5分：不能負(fù)重，后肢無(wú)活動(dòng)。翻身評(píng)分：0分：鼠背部放置后立即翻正；1分：不能翻正。位置評(píng)分：0分：當(dāng)大鼠在空中時(shí)，后肢抓住突出物身體懸在空中；1分：不能懸在空中。斜板實(shí)驗(yàn)：大鼠放置在測(cè)試面帶有淺溝槽的膠皮特制的斜板上，測(cè)量大鼠維持姿勢(shì)的能力、抓握能力和在斜板上至少停留5 s的最大角度并作為其功能值。每只大鼠測(cè)量3次，記錄分?jǐn)?shù)最高者。正常大鼠在斜板上停留的最大角度為80°。綜合得分情況評(píng)定大鼠缺血再灌注后24 h時(shí)神經(jīng)缺陷功能。

1.3.45-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2的mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)復(fù)制成功脊髓再灌注損傷的模型后24 h測(cè)定神經(jīng)功能，每組缺血再灌注120 min后處死大鼠迅速取出L5～7段脊髓組織，置入液態(tài)氮中凍存?zhèn)溆?。將其組織于RNA iso plus中研磨，氯仿抽提、75%乙醇沉淀組織內(nèi)RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。加入針對(duì)不同目標(biāo)基因片段的引物，暗室內(nèi)上樣后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析曲線并作統(tǒng)計(jì)分析。以目標(biāo)基因吸光度值與β-actin吸光度值的比值反映5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2的mRNA表達(dá)。

1.3.5Western blot法測(cè)定5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白的表達(dá)復(fù)制成功脊髓再灌注損傷的模型后24 h測(cè)定神經(jīng)功能，每組缺血再灌注120 min后處死大鼠迅速取出L5～7段脊髓組織，依照說(shuō)明書(shū)提取蛋白并測(cè)定其濃度。加預(yù)冷蛋白提取液稀釋于-70℃冰箱保存。相應(yīng)濃度和等量的樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，按次序加入相應(yīng)的一抗及二抗進(jìn)行免疫性反應(yīng)，DAB染色反應(yīng)，膜晾干后拍照，蛋白條帶密度的定量分析運(yùn)用凝膠圖像Image J軟件分析目標(biāo)蛋白條帶灰度值，以其與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值反映各物質(zhì)的表達(dá)水平。

1.3.6腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的檢測(cè)應(yīng)用ELISA檢測(cè)3組血清中TNF-α的含量，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

與S組比較，I/R組5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)，且NDS評(píng)分及血清TNF-α水平升高，I組5-LOX mRNA和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與I/R組比較，I組5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達(dá)下調(diào)，且NDS評(píng)分及血清TNF-α水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)附表和附圖。

附表3 組脊髓組織5-LOX、p-ERK1/2、t-ERK1/2和TNF-α的表達(dá)及NDS評(píng)分的比較（n=45，x±s）

附圖 各組5-LOX和p-ERK1/2蛋白的檢測(cè)

3 討論

研究證實(shí)，缺血再灌注損傷后24 h Beclin 1及LC3蛋白等自噬基因水平高，故本研究以此為研究時(shí)點(diǎn)[4]。結(jié)果表明，大鼠脊髓缺血再灌注時(shí)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分升高，表明大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型制備成功。本研究依照文獻(xiàn)的方法[9]進(jìn)行七氟醚預(yù)處理，結(jié)果表明七氟醚預(yù)處理可降低缺血再灌注期間神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，表明七氟醚預(yù)處理減輕了大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

本研究結(jié)果顯示，大鼠脊髓缺血再灌注期間5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，七氟醚預(yù)處理后其表達(dá)明顯下調(diào)，表明七氟醚預(yù)處理可通過(guò)下調(diào)5-LOX表達(dá)，抑制ERK1/2信號(hào)通路，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

脊髓缺血再灌注時(shí)，5-LOX激活蛋白首先活化，進(jìn)而引起5-LOX表達(dá)上調(diào)。5-LOX表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)p-ERK1/2表達(dá)和激活TNF-α，從而激活ERK1/2信號(hào)通路，釋放促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)脊髓損傷[10-11]。七氟醚下調(diào)5-LOX表達(dá)的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，七氟醚預(yù)處理可能通過(guò)下調(diào)5-LOX表達(dá)，抑制ERK1/2信號(hào)通路，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

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（張立芳 編輯）

Effect of sevoflurane preconditioning on expression of 5-lipoxygenase during spinal cord ischemia-reperfusion in rats*

Jun OU1,Hong ZHAO1,Hong XIE1,Xiao-tao SU1,Jun HE1,Jun HE1
(1.Department of Spinal Surgery,Nanhua Hospital Affiliated to University of South China,Hengyang, Hunan 421002,P.R.China;2.Teaching and Research Office of Basic Nursing,the School of Nursing,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of sevoflurane preconditioning on the expression of 5-lipoxygenase(5-LOX)during spinal cord ischemia-reperfusion(I/R)in rats.【Methods】Forty-five male adult Sprague-Dawley rats weighing 250～300g were randomly divided into 3 groups(n=15 each):sham operation group (group S);spinal cord I/R group(group I/R);sevoflurane preconditioning group(group I).The animals were anesthetized with intraperitoneal 4%chloral hydrate 0.1 mg/kg.Spinal cord ischemia was induced by 10 min occlusion of the thoracic aorta combined with controlled hypotension(MAP=40 mmHg).The rats inhaled 3.4% sevoflurane for 2 h and spinal cord I/R was produced 24 h later in group I.The neurological deficits were scored at 24 h of reperfusion.The animals were then sacrificed.The expression of 5-LOX,p-ERK1/2 and t-ERK1/2 protein and mRNA was detected using Western blot and RT-PCR respectively.TNF-α levels in serum were detected by ELISA.【Results】Compared with group S,the neurological deficit score and TNF-α levels in serum were significantly increased in groups I/R and I,the expression of 5-LOX and p-ERK1/2 protein and mRNA was up-regulated in group I/R,and the expression of 5-LOX mRNA and p-ERK1/2 protein and mRNA was up-regulated in group I(P<0.05).Compared with group I/R,the neurological deficit score was significantly lower,TNF-α levels in serum was lower,and the expression of 5-LOX and p-ERK1/2 protein and mRNA was lower in group I(P<0.05).【Conclusion】Sevoflurane preconditioning can reduce spinal cord I/R injury by down-regulating the expression of 5-LOX and inhibiting ERK1/2 signaling pathway in rats.

arachidonate 5-lipoxygenase;sevoflurane;ischemic preconditioning;reperfusion injury;spinal cord

R-332

A

1005-8982（2015）25-0012-04

2015-01-17

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No：2013FJ4212）；湖南省教育廳資助項(xiàng)目（No：14B157）