外生菌根真菌Xerocomus chrysenteron產(chǎn)漆酶能力及其對(duì)外加DDT和重金屬的響應(yīng)

趙曦，黃藝，李娟

1. 深圳市環(huán)境科學(xué)研究院，廣東 深圳 518001；2. 北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871

外生菌根真菌Xerocomus chrysenteron產(chǎn)漆酶能力及其對(duì)外加DDT和重金屬的響應(yīng)

趙曦1*，黃藝2，李娟1

1. 深圳市環(huán)境科學(xué)研究院，廣東 深圳 518001；2. 北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871

為評(píng)價(jià)外生菌根真菌紅絨蓋牛肝菌（Xerocomus chrysenteron）在不同營(yíng)養(yǎng)條件和污染條件下產(chǎn)漆酶的能力，采用改良的Kottke營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法研究了不同碳氮比、DDT處理和重金屬處理對(duì)X. chrysenteron漆酶活性的影響，探討了不同處理對(duì)漆酶活性的影響機(jī)制。結(jié)果表明：（1）X. chrysenteron漆酶粗酶對(duì)底物ABTS的米氏常數(shù)Km值為0.038 mmol·L-1。在接種X. chrysenteron后，漆酶活性的峰值出現(xiàn)在菌絲生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，靜置培養(yǎng)63 d后漆酶活性可達(dá)118 U·L-1。在靜置和振蕩條件下，X. chrysenteron在改良的Kottke營(yíng)養(yǎng)液中的最大產(chǎn)漆酶量均為157 U·L-1，振蕩培養(yǎng)不能提高最大漆酶產(chǎn)量。高的碳氮比條件下（葡萄糖與(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度之比為20）可以獲得較大的漆酶活性。（2）在培養(yǎng)的第54天，1 mg·L-1DDT和5 mg·L-1DDT處理的培養(yǎng)基中的漆酶活性相比對(duì)照分別提高了0.5倍和1倍，顯示出DDT對(duì)產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)作用。（3）低濃度（1 mmol·L-1）的不同重金屬對(duì)X. chrysenteron漆酶活性有不同的影響，在培養(yǎng)的第54天，Cu和Cd能夠?qū)⑵崦富钚苑謩e提高2.6倍和0.3倍，Mn對(duì)漆酶活性沒有明顯的影響，Zn降低了漆酶活性，Hg則完全抑制了漆酶活性。高濃度的Cu（5 mmol·L-1）對(duì)漆酶活性的提高不明顯，而高濃度的Cd（5 mmol·L-1）則降低了漆酶活性。重金屬對(duì)X. chrysenteron漆酶活性的影響機(jī)制可能包括通過對(duì)漆酶基因的誘導(dǎo)或抑制，以及對(duì)菌絲生物量的影響，進(jìn)而對(duì)漆酶活性產(chǎn)生影響。研究表明，高的碳氮比、適當(dāng)質(zhì)量濃度的DDT處理及低濃度的Cu、Cd處理均能促進(jìn)X. chrysenteron產(chǎn)漆酶，顯示出其在POPs和重金屬復(fù)合污染環(huán)境下對(duì)POPs的降解潛力。

外生菌根真菌；Xerocomus chrysenteron；漆酶；DDT；重金屬

外生菌根真菌（英文名ectomycorrhizal fungi，簡(jiǎn)稱ECMF）具有降解持久性有機(jī)污染物（英文名persistent organic pollutants，簡(jiǎn)稱POPs）的能力。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已經(jīng)進(jìn)行的外生菌根真菌降解POPs的研究中，45種菌種中有36種能降解至少一類POPs，有12種能降解多類POPs（趙曦等，2007）。DDT是一種有機(jī)氯農(nóng)藥，也是POPs的一種。本研究課題組分別于2007年和2013年首次報(bào)道了外生菌根真菌X.chrysenteron對(duì)DDT的降解作用（Huang等，2007）和礦化作用（Huang和Wang，2013）。

外生菌根真菌對(duì)DDT的這種降解和礦化作用可能與其產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶密切相關(guān)。大量研究表明外生菌根真菌能產(chǎn)生一系列與白腐真菌木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)相似的酶，這些酶具有降解POPs的巨大潛力（Meharg和Cairney，2000）。在木質(zhì)素降解酶系的三種酶中，漆酶的生成不需要嚴(yán)格的限碳和限氮條件且無需大量的 H2O2作為輔助劑，因此相比木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）具有更實(shí)際的應(yīng)用前景。一些研究者直接采用從白腐真菌提取的漆酶對(duì)土壤中的 DDT進(jìn)行處理，得了較高的DDT降解率（Zhao等，2010；Fan等，2013），顯示出真菌漆酶在POPs污染環(huán)境生物修復(fù)中的應(yīng)用前景。

土壤環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)條件復(fù)雜，而且當(dāng)前環(huán)境中的污染物也趨于多元化和復(fù)雜化，環(huán)境污染逐漸以由各種污染物構(gòu)成的復(fù)合污染為主（鄭振華，2001）。復(fù)合污染土壤的生物修復(fù)逐漸成為研究熱點(diǎn)，有研究者報(bào)道了采用植物和微生物結(jié)合的方式，對(duì)DDT和 Cd復(fù)合污染土壤的生物修復(fù)研究（Zhu等，2012）。外生菌根真菌對(duì)重金屬有較好的耐受性（張英偉等，2014），其在POPs和重金屬復(fù)合污染環(huán)境下的產(chǎn)酶及對(duì) POPs的降解效果研究具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究文通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討 X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的能力及不同碳氮比、DDT處理和重金屬處理對(duì)X. chrysenteron漆酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

實(shí)驗(yàn)所用菌種為紅絨蓋牛肝菌（Xerocomus chrysenteron），采自北京西山無污染的針闊混交林，由北京林業(yè)大學(xué)森林病理研究室雷增普教授提供。

1.1.2 液體培養(yǎng)

將改良的Kottke營(yíng)養(yǎng)液（Kottke等，1987）pH調(diào)至5.5，加入250 mL三角瓶，1.4×105Pa下126 ℃高溫滅菌20 min，冷卻。在無菌操作環(huán)境下，分別接種供試菌種于液體培養(yǎng)基上，封口，在 25 ℃下培養(yǎng)，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

對(duì)照：制備改良Kottke液體培養(yǎng)基，每個(gè)250 mL三角瓶加入100 mL培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。接種3片9 mm直徑的X. chrysenteron固體培養(yǎng)瓊脂塊。封口，在25 ℃無光靜置培養(yǎng)。

振蕩培養(yǎng)：除采用100 r·min-1轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，其他同對(duì)照。

不同C質(zhì)量濃度：以對(duì)照的10 g·L-1葡萄糖質(zhì)量濃度為基準(zhǔn)，設(shè)置葡萄糖質(zhì)量濃度為5和20 g·L-1的處理。

不同 N質(zhì)量濃度：以對(duì)照的 0.5 g·L-1(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度為基準(zhǔn)，設(shè)置(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度為0.25和1 g·L-1的處理。

DDT處理：在接種后的第18天，加入DDT使質(zhì)量濃度達(dá)到1.0和5.0 mg·L-1。

重金屬處理：在接種后的第 18天，分別加入CuSO4、CdCl2、MnSO4、ZnSO4、HgI2使?jié)舛冗_(dá)到1 mmol·L-1。另外加設(shè)Cu和Cd的高濃度處理，分別加入CuSO4、CdCl2使?jié)舛冗_(dá)到5 mmol·L-1。

每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。所有處理在接種18 d后，每3 d取樣測(cè)定。

1.3 漆酶粗酶的提取方法

從培養(yǎng)有外生菌根真菌的三角瓶中取 500 μL培養(yǎng)液，用注射器配0.2 μm孔徑的濾頭過濾，制得漆酶粗酶液。置于1.5 mL V型離心管中，4 ℃以下冷藏待測(cè)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 漆酶活性定量測(cè)定

以 ABTS (英 文 名 2, 2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) )為漆酶活性底物。3 mL的反應(yīng)體系包括 0.5 mmol·L-1ABTS，100 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH 5.0），和0.1 mL粗酶液。25 ℃下，通過加入粗酶液來啟動(dòng)反應(yīng)。測(cè)A420下的吸光度的變化速率。1個(gè)單位（U）的酶活性定義為 25 ℃下每分鐘氧化 1 μmol ABTS（ε=36 L·mmol-1·cm-1）所需酶量。

1.4.2 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以 ABTS為漆酶活性底物，測(cè)定不同濃度ABTS下的酶反應(yīng)速率。

1.4.3 菌絲干質(zhì)量測(cè)定

對(duì)液體培養(yǎng)基用真空泵（SHB-III）直接抽濾。將菌絲體連同濾紙一起在105 ℃烘箱內(nèi)滅菌1 h，再置于烘箱內(nèi)80 ℃下烘干24 h，干燥器內(nèi)冷卻48 h，恒質(zhì)量后用分析天平（AR1140）測(cè)量干質(zhì)量。

1.4.4 剩余葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定

采用蒽酮比色法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算采用 Microsoft Office Excel 2003軟件。t檢驗(yàn)采用SPSS13.0軟件。產(chǎn)酶曲線擬合采用Origin 8.0軟件，Logistic方程擬合，N=K/(1+exp(a-rt))。

2 結(jié)果與分析

2.1 X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的特性

2.1.1 X. chrysenteron漆酶產(chǎn)粗酶的酶動(dòng)力學(xué)特征

測(cè)定在不同濃度底物（ABTS）的反應(yīng)體系中X. chrysenteron漆酶粗酶反應(yīng)的初速度，并采用最小二乘法回歸求解（圖1）。結(jié)果顯示，X. chrysenteron漆酶粗酶具有典型的酶動(dòng)力學(xué)特征（v=20.24c/(0.038+c)，r2=0.996），其米氏常數(shù)Km值為0.038 mmol·L-1。

Km值反映的是酶對(duì)底物親和力的大小，Km值越小，酶對(duì)底物的親和力越大，其催化反應(yīng)的效率就越高。目前鮮見關(guān)于外生菌根真菌的漆酶酶動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道，而白腐真菌漆酶的相關(guān)文獻(xiàn)較多，例如白腐真菌 Pycnoporus sanguineus、Pleurotus sajor-caju、Fomes fomentarius、Panus conchatus的漆酶降解ABTS的Km值依次為0.13、0.089、0.026和0.0057 mmol·L-1（Derek等，2007；Paolo等，2011；Mohamed和Atef，2010；張麗等，2013）?？梢姡琗. chrysenteron漆酶粗酶對(duì)ABTS的親和力與幾種高產(chǎn)漆酶的白腐真菌相比，處于中等水平。

2.2.2 不同培養(yǎng)階段X. chrysenteron產(chǎn)漆酶活性

對(duì)在靜置的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 X.chrysenteron的菌絲干質(zhì)量及其產(chǎn)生的漆酶進(jìn)行連續(xù)測(cè)定（圖2）。根據(jù)菌絲的生長(zhǎng)曲線分析，在接種X. chrysenteron靜置的液體培養(yǎng)基中，接種后的0～6 d為菌絲生長(zhǎng)的調(diào)整期，6～18 d為菌絲生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，18 d之后為菌絲生長(zhǎng)的穩(wěn)定期。在 X. chrysenteron菌絲生長(zhǎng)的調(diào)整期和對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)基中只檢測(cè)到少量的漆酶。而在菌絲生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，漆酶活性逐漸呈現(xiàn)出對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，并在第63天達(dá)到了118 U·L-1。

圖1 X. chrysenteron漆酶粗酶氧化ABTS的米氏方程擬合曲線Fig. 1 Fitting curve of Michaelis-Menten equation for oxidation of ABTS by crude laccase from X. chrysenteron

圖2 X. chrysenteron在靜置的Kottke培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時(shí)間線Fig. 2 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in Kottke medium

與多種白腐真菌在接種的菌絲生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期即達(dá)到漆酶活性峰值相比（張麗等，2013；尚潔等，2013），X. chrysenteron漆酶活性在菌絲生長(zhǎng)穩(wěn)定期才達(dá)到很高的濃度，63 d之后可達(dá)118 U·L-1，產(chǎn)酶量與多種漆酶高產(chǎn)白腐真菌的漆酶產(chǎn)量相當(dāng)。大量研究表明，不同的白腐真菌的菌種，由于其漆酶基因的差異，表達(dá)階段差別較大，例如，白腐真菌Trametes sp.I62的漆酶基因有l(wèi)cc1和lcc2兩種，前者在菌絲生長(zhǎng)的早期即可表達(dá)，而后者在菌絲生長(zhǎng)的穩(wěn)定期才能表達(dá)（Mansur等，1998）。X. chrysenteron的在菌絲生長(zhǎng)穩(wěn)定期表達(dá)的特征，應(yīng)與其漆酶基因的類型密切相關(guān)。

2.2.3 正常培養(yǎng)下X. chrysenteron最大漆酶活性

振蕩培養(yǎng)條件下的漆酶活性增長(zhǎng)速度比靜置條件下快，對(duì)靜置和振蕩條件下的產(chǎn)酶曲線進(jìn)行非線性擬合（圖 3），兩個(gè)產(chǎn)酶曲線都較好地符合Logistic曲線L=K/(1+exp(a-rt))：

圖3 X. chrysenteron在Kottke培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時(shí)間線Fig. 3 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in Kottke medium

其中，K表示最大產(chǎn)酶量；a表示與初始產(chǎn)酶量有關(guān)的參數(shù)；r表示酶量瞬時(shí)增長(zhǎng)率。

這個(gè)結(jié)果表明，培養(yǎng)體系中漆酶的積累模式符合 Logistic曲線，具有一個(gè)增長(zhǎng)極限值，即最大產(chǎn)酶量。在靜置和振蕩條件下，X. chrysenteron在改良的Kottke營(yíng)養(yǎng)液中的最大產(chǎn)漆酶量均為157 U·L-1。

2.3 不同碳、氮條件下X. chrysenteron漆酶產(chǎn)量

碳源和氮源的質(zhì)量濃度和種類及其比值對(duì)漆酶活性影響較大，其中氮源起著關(guān)鍵作用（Eggert等，1996）。接種的第54天（表1），本研究中使用的正常 Kottle培養(yǎng)基的碳源葡萄糖質(zhì)量濃度為 10 g·L-1，氮源(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降為5 g·L-1時(shí)，X. chrysenteron漆酶產(chǎn)量比正常Kottle培養(yǎng)基中的漆酶產(chǎn)量減少了74%（P<0.001）；而當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度增至20 g·L-1時(shí)，漆酶產(chǎn)量與正常Kottle培養(yǎng)基中的漆酶產(chǎn)量之間沒有顯著性差異（P=0.461）。當(dāng)(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度降為 0.25 g·L-1時(shí)，漆酶產(chǎn)量沒有明顯變化（P=0.668）；而當(dāng)(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度增為 1 g·L-1時(shí)，漆酶產(chǎn)量比正常Kottle培養(yǎng)基中的漆酶產(chǎn)量減少了61%（P<0.001）。從C/N比來看，C/N比降低到10時(shí)，漆酶活性變??；而C/N比提高至40，漆酶活性并不能有效提高。限氮條件有利于提高漆酶活性。

表1 接種54 d后不同C/N比下X. chrysenteron的漆酶活性Table1 Laccase activity in X. chrysenteron medium of various carbon/nitrogen ratios after 54 d of culture

2.4 DDT對(duì)X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的影響

在本研究課題組報(bào)道的酶點(diǎn)試實(shí)驗(yàn)中，DDT增強(qiáng)了外生菌根真菌X. chrysenteron的漆酶活性（黃藝等，2006）。為了確證這一結(jié)果，添加DDT到接種X. chrysenteron 18 d后的液體培養(yǎng)基中，使DDT質(zhì)量濃度達(dá)到1和5 mg·L-1。第45天后，添加DDT的培養(yǎng)液中漆酶活性顯著增強(qiáng)。在第54天，1和5 mg·L-1DDT處理的培養(yǎng)基中的漆酶活性分別比對(duì)照提高了0.5倍（P=0.010）和1倍（P=0.005）（圖4）。

圖4 X. chrysenteron在對(duì)照及添加1和5 mg·L-1DDT培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時(shí)間線Fig. 4 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in unsupplemented medium and medium containing 1 and 5 mg·L-1DDT

2.5 重金屬對(duì)X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的影響

為了探討重金屬對(duì)漆酶的影響，本研究選擇了Cd2+、Cu2+、Hg+、Mn2+、Zn2+等5種重金屬離子作為添加物和潛在的漆酶誘導(dǎo)劑。圖5顯示了在各種重金屬以 1 mmol·L-1濃度存在的情況下，X. chrysenteron產(chǎn)漆酶時(shí)間線。

圖5 X. chrysenteron在對(duì)照及添加1 mmol·L-1Cu、Cd、Mn、Zn和Hg培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時(shí)間線Fig. 5 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in unsupplemented medium and medium containing 1 mmol·L-1Cu, Cd, Mn, Zn and Hg

Cu是本研究中最有效的漆酶誘導(dǎo)劑，在加入到培養(yǎng)基后很快就誘導(dǎo)了 X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)生。Cu處理的培養(yǎng)基和對(duì)照（正常培養(yǎng)基中Cu的濃度為0.05 μmol·L-1）之間漆酶活性的差距隨著時(shí)間推移而擴(kuò)大。在第54天，Cu處理的培養(yǎng)基中漆酶活性比對(duì)照提高了2.6倍（P<0.001）。作為一種生物非必需元素，Cd也提高了X. chrysenteron胞外漆酶的產(chǎn)量。在第54天，Cd處理的培養(yǎng)基中漆酶活性比對(duì)照提高了0.3倍（P=0.197）。與Cu和Cd的誘導(dǎo)效果相反，其他3種重金屬都抑制了漆酶的產(chǎn)量。Mn（P=0.045）和 Zn（P=0.002）降低了漆酶的活性，而在 Hg的處理下漆酶活性完全消失（P<0.001）。

重金屬對(duì)酶的作用與其濃度有很大關(guān)系?？紤]到在1 mmol·L-1濃度的Mn，Zn和Hg的處理下，漆酶活性已經(jīng)受到抑制，因此只對(duì)Cu和Cd設(shè)計(jì)5 mmol·L-1的高濃度處理，并做進(jìn)一步研究。兩種濃度的Cu處理都提高了漆酶活性。不過，高濃度的Cu（5 mmol·L-1）對(duì)漆酶活性的提高不明顯（P=0.430），而高濃度的Cd（5 mmol·L-1）則降低了漆酶活性（P=0.032）（表2）。

值得注意的是，在5 mmol·L-1Cu和Cd處理下，X. chrysenteron的生長(zhǎng)受到了抑制，生物量分別下降了32%和24%。這表明，重金屬離子可以直接抑制或增強(qiáng)X. chrysenteron的產(chǎn)漆酶能力，也可以通過抑制菌絲生物量來間接降低漆酶活性。在本研究中，菌絲生物干質(zhì)量和葡萄糖剩余量的結(jié)果顯示 5 mmol·L-1的Cu以及Cd、1 mmol·L-1的Zn和Hg都抑制了菌絲的生長(zhǎng)（表2）。

處理 漆酶活性/(U·L-1) 單位菌絲干質(zhì)量漆酶活性/(U·g-1) 菌絲干質(zhì)量/g ρ(剩余葡萄糖)/(g·L-1)對(duì)照 81.5±8.0 63.67 0.128±0.008 0.33±0.06 1 mmol·L-1Cu 290.2±24.9 263.8 0.110±0.016 0.36±0.04 5 mmol·L-1Cu 109.4±65.6 125.1 0.087±0.009 0.47±0.13 1 mmol·L-1Cd 105.6±32.3 104.4 0.101±0.010 0.31±0.27 5 mmol·L-1Cd 63.3±10.6 64.6 0.098±0.003 0.24±0.02 1 mmol·L-1Mn 57.1±17.7 48.7 0.117±0.004 0.28±0.03 1m mmol·L-1Zn 29.6±18.8 29.9 0.099±0.009 0.30±0.00 1 mmol·L-1Hg 0.0±0.0 0.0 0.092±0.010 0.85±0.38

3 討論

X. chrysenteron是一種外生菌根擔(dān)子菌（Triguerosa等，2003）。County等（2006）發(fā)現(xiàn)在法國(guó)的一個(gè)自然林土壤環(huán)境下，X. chrysenteron在多個(gè)外生菌根真菌菌種中表現(xiàn)出了最強(qiáng)的漆酶活性。Luis等（2005）認(rèn)為X. chrysenteron具有典型的漆酶基因，并用該菌種的漆酶基因來對(duì)德國(guó)巴伐利亞北部的針闊混交林中的土壤樣品提取出的漆酶轉(zhuǎn)錄序列進(jìn)行歸類。本研究的結(jié)果驗(yàn)證了 X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的能力，并且該菌的漆酶基因可能主要在菌絲生長(zhǎng)的穩(wěn)定期表達(dá)。在改良的Kottke營(yíng)養(yǎng)液中，培養(yǎng) 63 d后產(chǎn)漆酶量可達(dá) 118 U·L-1，與多種漆酶高產(chǎn)白腐真菌產(chǎn)漆酶水平相當(dāng)（Derek等，2007；Paolo等，2011；Mohamed和Atef，2010；張麗等，2013；尚潔等，2013）。正是由于X. chrysenteron的這種較強(qiáng)產(chǎn)漆酶能力，本研究課題組選擇該菌種作為外生菌根真菌降解 DDT和產(chǎn)漆酶研究的模式菌種。

一般認(rèn)為，對(duì)產(chǎn)漆酶真菌采用振蕩培養(yǎng)方式可以獲得較高的漆酶活性，因?yàn)檎袷幣囵B(yǎng)提高了營(yíng)養(yǎng)物和氧氣在細(xì)胞間的傳質(zhì)效率（高大文等，2005）。本研究中靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)的最大產(chǎn)酶量一致，振蕩培養(yǎng)只是縮短了菌絲生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，使其提前進(jìn)入了生長(zhǎng)穩(wěn)定期并大量產(chǎn)酶，但并沒有最終提高其產(chǎn)漆酶的能力。這一點(diǎn)與其他學(xué)者的結(jié)論一致，Collins和 Dobson（1997）的研究表明，氧氣量的增加既不能促進(jìn)真菌漆酶mRNA的轉(zhuǎn)錄，也不能提高真菌產(chǎn)漆酶的能力。

碳、氮的含量和種類及碳氮比對(duì)真菌漆酶產(chǎn)量起著關(guān)鍵作用。在白腐真菌中，漆酶的生成主要通過營(yíng)養(yǎng)限制（主要是限N）來啟動(dòng)。本研究中，無論C含量和N含量如何變化，C/N比（葡萄糖質(zhì)量濃度/(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度）都是影響漆酶產(chǎn)量的最主要因素。Kottke正常培養(yǎng)基的C/N比為20，此條件下即可獲得較高的漆酶活性。相比無機(jī)氮，有機(jī)氮能夠因其能提高生物量而進(jìn)一步提高漆酶活性（Arora和 Rampal，2002）。本研究中使用的氮源(NH4)2HPO4為無機(jī)氮，若更換為有機(jī)氮源，也許能進(jìn)一步激發(fā)X. chrysenteron的產(chǎn)漆酶和降解DDT的能力。

本研究證實(shí)了 DDT能夠刺激外生菌根真菌的漆酶合成。Ritch和Gold（1992）、Soden和Dobson（2001）和 Xiao等（2006）分別在白腐真菌 P. chrysosporium、P. sajor-caju和Trametes sp. AH28-2的漆酶基因lac的啟動(dòng)子中均發(fā)現(xiàn)了異生化合物結(jié)合序列（英文名xenobiotic responsive elements，簡(jiǎn)稱XREs），該XREs編碼的結(jié)合蛋白能夠和許多異生芳環(huán)化合物結(jié)合（Fujisawa-Sehara等，1987）。鑒于外生菌根真菌漆酶基因和白腐真菌漆酶基因的同源性（Chen等，2003），可以推測(cè)，外生菌根真菌漆酶基因可能含有相似的XREs，而DDT作為一種異生芳環(huán)化合物，可能在基因水平上影響了外生菌根真菌的漆酶生成。

一些重金屬能在基因轉(zhuǎn)錄水平上提高真菌漆酶的產(chǎn)量，其中Cu是已經(jīng)被大量文獻(xiàn)廣泛確認(rèn)的真菌產(chǎn)漆酶誘導(dǎo)劑（Alessandra等，2011；Galhaup和 Haltrich，2001）。在本研究中，Cu提高了 X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量，不過提高的幅度（2.6倍）與一些文獻(xiàn)報(bào)道的幅度（增加1～3個(gè)數(shù)量級(jí)）尚顯偏低（Alessandra等，2011），可能與本研究選擇的Cu濃度有關(guān)。這些文獻(xiàn)采用的 Cu濃度在 0.15～1 mmol·L-1之間，而本研究采用的是1 mmol·L-1。雖然 Cu是漆酶合成的必需元素，但是高濃度的 Cu能夠抑制菌絲的生長(zhǎng)。在本研究培養(yǎng)的后期，5 mmol·L-1Cu 處理中菌絲的干質(zhì)量只有(0.087±0.009) g，甚至比1 mmol·L-1Hg處理中菌絲的干質(zhì)量(0.092±0.010) g還低。這表明在高濃度Cu處理下，X. chrysenteron的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制。另外，高濃度的Cu也有可能抑制了漆酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。誘導(dǎo) X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的最佳 Cu濃度可能應(yīng)低于1 mmol·L-1。

有研究表明，低濃度的Cd能促進(jìn)白腐真菌的漆酶活性（Baldrian和Gabriel，2002）以及外生菌根真菌 Paxillus involutus漆酶基因的轉(zhuǎn)錄水平（Jacob等，2004）。在本研究中，低濃度的Cd提高了X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量，而高濃度的Cd降低了X. chrysenteron的漆酶產(chǎn)量，不過對(duì)菌絲的生長(zhǎng)卻沒有太大的影響（5 mmol·L-1處理中菌絲干質(zhì)量(0.098±0.003) g；1 mmol·L-1處理中菌絲干質(zhì)量(0.101±0.010） g。這個(gè)結(jié)果表明，在5 mmol·L-1Cd處理下X. chrysenteron漆酶產(chǎn)量的下降主要原因可能是Cd對(duì)漆酶轉(zhuǎn)錄的抑制而不是菌絲生長(zhǎng)的抑制。Jacob等（2004）的研究也表明，外生菌根真菌 P. involutus漆酶RNA的合成在0.05 ppm Cd處理下顯著提高，而在5 ppm Cd處理下受到抑制。因此，高濃度的Cu和Cd對(duì)X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量影響機(jī)理有所不同，高濃度的Cu主要通過抑制菌絲生長(zhǎng)來影響漆酶產(chǎn)量，而高濃度的Cd則主要通過抑制漆酶mRNA的轉(zhuǎn)錄來影響漆酶產(chǎn)量。

Mn也被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)真菌產(chǎn)漆酶，Scheel等（2000）發(fā)現(xiàn)0.133 mmol·L-1的Mn提高了3種白腐真菌漆酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，Soden和Dobson（2001）也發(fā)現(xiàn)Mn可以誘導(dǎo)真菌P. sajor caju、Clitocybula dusenii和Nematoloma frowardii產(chǎn)漆酶。不過本研究中1 mmol·L-1的Mn處理對(duì)X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量沒有明顯的影響，可能與Mn對(duì)漆酶的誘導(dǎo)作用具有菌種差異性有關(guān)，也可能與Mn濃度偏高有關(guān)。Manubens等（2007）的研究表明0.16～0.194 mmol·L-1的Mn可以抑制真菌C. subvermispora產(chǎn)漆酶。

Collins和 Dobson（1997）的研究表明0.0004～0.2 mmol·L-1的Zn對(duì)漆酶基因轉(zhuǎn)錄沒有影響（Collins和Dobson，1997）。本研究中，1 mmol·L-1的Zn在沒有誘導(dǎo)作用的前提下，由于抑制了菌的生長(zhǎng)，而降低了菌的漆酶產(chǎn)量。

4 結(jié)論

（1）外生菌根真菌X. Chrysenteron具有很強(qiáng)的產(chǎn)漆酶能力，且 DDT對(duì)其產(chǎn)漆酶具有誘導(dǎo)作用。目前已經(jīng)有許多研究采用白腐真菌漆酶降解土壤DDT（Zhao等，2010；Fan等，2013），菌根真菌X. Chrysenteron及其漆酶在DDT污染土壤的修復(fù)中具有實(shí)際應(yīng)用潛力。

（2）在低濃度的Cu2+和Cd2+等重金屬離子的處理下，X. Chrysenteron的產(chǎn)漆酶能力有所提高，顯示出其在 POPs和重金屬復(fù)合污染環(huán)境下對(duì) POPs的降解潛力。

（3）碳源和氮源的選擇及 C/N 比對(duì) X. Chrysenteron 的產(chǎn)漆酶能力影響很大，X. Chrysenteron的產(chǎn)漆酶能力在合適的營(yíng)養(yǎng)條件下，應(yīng)還有較大的提升空間。

DDT和重金屬復(fù)合處理對(duì)X. Chrysenteron漆酶活性的影響，以及復(fù)合污染環(huán)境下 X. Chrysenteron對(duì)DDT的降解效果，尚需通過進(jìn)一步研究探討。

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Efficiency of Laccase Secretion by the Ectomycorrhizal Fungus Xerocomus chrysenteron and Its Responses to the Addition of DDT and Heavy Metals

ZHAO Xi1, HUANG Yi2, LI Juan1
1. Shenzhen Academy of Environmental Sciences, Shenzhen 518001, China; 2. College of Environmental Science and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China

The efficiency of laccase secretion by the ectomycorrhizal fungus Xerocomus chrysenteron and its responses to medium carbon: nitrogen ratio and the addition of DDT and heavy metals were studied in the modified Kottke medium. Additionally, the mechanisms underlying the observed responses were explored. Laccase secreted by X. chrysenteron showed high affinity for degrading 2,2'-azino-bis(3-ethylthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) with a half saturation constant (Km) of 0.038 mmol·L-1. Laccase activity was found to be highest at the stationary phase and reached 118 U·L-1after 63 d of culture. The maximum laccase activity could reach 157 U·L-1in both the static culture and the shaking culture. Elevating medium carbon: nitrogen ratio to 20 led to higher laccase activity. Adding 1 mg·L-1and 5 mg·L-1of DDT increased the laccase production by 0.5 and 1 fold after 63 d of culture, respectively. Adding 1 mmol·L-1of different heavy metals showed differential effects on laccase production. Cu and Cd increased the laccase production by 2.6 and 0.3 fold after 63 d of culture, respectively; Zn and Hg inhibited the laccase production; Mn showed no significant effects. Adding 5 mmol·L-1of Cu had no significant effects on the laccase production, while 5 mmol·L-1of Cd decreased the laccase production. These effects of heavy metals may be explained by laccase induction (or inhibition) and decreases in mycelium production caused by the metals. This study demonstrated that high carbon: nitrogen ratio and the addition of suitable concentrations of DDT, Cu and Cd could promote the laccase production by X. chrysenteron, suggesting the potential application of this fungus for degrading POPs in multiple-contaminant environment.

ectomycorrhizal fungi; Xerocomus chrysenteron; laccase; DDT; heavy metals

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.02.023

X171.5

A

1674-5906（2015）02-0329-07

趙曦，黃藝，李娟. 外生菌根真菌Xerocomus chrysenteron產(chǎn)漆酶能力及其對(duì)外加DDT和重金屬的響應(yīng)[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2015, 24(2): 329-335.

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國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41271325）

趙曦（1982年生），男，工程師，主要從事重金屬和持久性有機(jī)污染物的環(huán)境影響與污染防治研究。E-mail: zhaoxi5257@sina.com

2015-01-14